山西太原地区MTHFR 和MTRR 基因多态性与高同型半胱氨酸脑卒中的相关性

李瑞蓉 李玉串 韩惠萍 赵爱明 柴里京

作者单位：030006 山西太原，山西省针灸医院检验科（李瑞蓉、韩惠萍、赵爱明、柴里京）030032 山西太原，山西白求恩医院检验科（李玉串）

根据2020 年中国脑卒中报告，脑卒中已成为我国居民死亡的首位原因［1］。国家卫生健康委脑卒中防治工程委员会2020 年中国卒中高危人群筛查干预工作调查表明，中国40 岁以上人群脑卒中患者约有1 780 万名，新发现卒中患者340 万名，卒中相关死亡患者230 万名［2］。全世界90%的脑卒中患者发病与高血压、糖尿病、血脂异常等10 项可改变危险因素有关，其中高血压位居榜首，另外血清同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）水平升高也是影响高血压发病的重要危险因素之一。亚甲基四氢叶酸还原酶（methylenetetrahydrofolatereductase，MTHFR）以及甲硫氨酸合成酶还原酶（methionine synthase reductase，MTRR）是人体内参与叶酸代谢的关键酶，能够介导清除人体中的Hcy，促进DNA甲基化反应。常进等［3］研究表明，MTHFR 基因C677T 位点多态性与高血压的风险有关，是高血压发病的主要危险因素。MTHFR 和MTRR 基因多态性会造成酶活性下降，引发叶酸代谢障碍，从而导致DNA 的低甲基化，以及高同型半胱氨酸血症，引起脑卒中的发生。宋俊丽等［4］研究山西地区MTHFR C677T 基因多态性及其与Hcy 的关系，但MTHFR C677T、MTHFR 1298C 和MTRR A66G 位点与高同型半胱氨酸脑卒中的相关性研究尚未见报道。本研究选择脑卒中患者和同期体检者作为研究对象，了解山西太原地区MTHFR 基因多态性与高同型半胱氨酸脑卒中的相关性，现将结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选择2019 年1—8 月在山西白求恩医院和山西省针灸医院就诊的300 例脑卒中患者作为脑卒中组，另外选择310 名同期健康体检者作为对照组。

1.1.1 纳入标准 ① 年龄＞18 岁；② 脑卒中患者经头颅磁共振成像检查，符合脑卒中的诊断标准。

1.1.2 排除标准 ① 严重心、肝、肾功能不全；② 自身免疫性疾病；③ 恶性肿瘤；④ 颅脑创伤、外伤。

1.1.3 伦理学 本研究符合医学伦理学标准，经山西省针灸研究所生物医学研究伦理委员会批准（审批号：ZYLS2018005），所有受试者均自愿参与研究，并签署临床研究知情同意书。

1.2 研究方法

1.2.1 仪器与试剂 使用日立7180 全自动生化分析仪，采用循环酶法检测Hcy，试剂盒购自南京威特曼生物试剂有限公司。基因多态试剂盒和全血DNA 提取试剂盒购自武汉友芝友医疗科技股份有限公司。PQD-96A 荧光定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）仪购自杭州博日科技股份有限公司。

1.2.2 血清Hcy 检测 采用无抗凝剂真空采集管，采集受检者外周静脉血3 mL，置于37 ℃水浴箱至血样凝固，以3 500 r/min（离心半径13.5 cm）离心5 min，取上层血清检测Hcy，正常参考值范围0～20 μmol/L。血清Hcy≥20 μmol/L 定义为高同型半胱氨酸血症。

1.2.3 叶酸代谢基因多态性检测 采集受检者空腹外周静脉血2 mL，采用抗凝真空采血管进行人全血DNA 提取，试剂盒提取总DNA 后于-20 ℃备用。采用PCR 方法，检测MTHFR、MTRR 基因（MTHFR C677T、 MTHFR 1298C 和MTRR A66G）多态性。以提取的DNA 为模板进行PCR 扩增，流程为尿嘧啶-N-糖基化酶（uracil-N-glylosylase，UNG 酶）处理37 ℃ 105 min，预变性95 ℃ 5 min，95 ℃ 15 s， 60 ℃60 s（40 个循环），在此阶段结束时采集荧光信号，设置阳性对照和阴性对照，与标本一起扩增。根据检测结果判读基因型，包括MTHFR C677T 位点（CC、CT、TT）和MTHFR A66G 位点（AA、AG、GG）。

1.3 检测原理 针对MTHFR、MTRR 基因的不同多态性位点，设计可与探针结合的特异性引物，反应体系中通过两种通道对一个位点的基因多态性进行监测。在反应体系中含有不同基因模板时，PCR 反应开始，并释放不同的荧光信号。PCR 过程中相应通道的信号强度可通过仪器进行实时监测和输出，对检测结果进行定性分析。

1.4 统计学分析 采用SPSS 26.0 统计软件处理数据。计数资料以例（%）表示，采用χ2检验和趋势χ2检验进行组间构成比或率的比较。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 对照组与脑卒中组MTHFR 基因多态性基因型分布比较 比较对照组与脑卒中组MTHFR C677T、MTHFR 1298C、MTHFR A66G 位点不同基因型的分布频率，对照组和脑卒中组的TT、CC、GG 基因型频率比较差异均有统计学意义（均P＜0.05）。见表1。

表1 对照组与脑卒中组的MTHFR C677T、MTHFR 1298和MTRR A66G 位点的基因型分布

2.2 不同Hcy 水平脑卒中患者MTHFR C677 位点的基因型分布特征 根据脑卒中患者血清Hcy水平分组，Hcy 为5～15 μmol/L 人数为142 人（占46.7%）。Hcy＞20 μmol/L 人数为158 人（占52.7%）。对不同血清Hcy 水平脑卒中患者MTHFR C677T 位点的基因型进行统计分析，CT 基因型在Hcy 水平为5～15 μmol/L 的患者中分布频率较高，而TT 基因型在Hcy＞20 μmol/L 的患者中分布频率较高，且分布频率随着Hcy 水平升高而升高（P＜0.05）。不同Hcy 水平的脑卒中患者不同基因型频率比较总体差异具有统计学意义（P＜0.01）。见表2。

表2 不同Hcy 水平脑卒中患者MTHFR C677T位点的基因型分布特征

3 讨论

MTHFR 是叶酸代谢过程中的关键酶，也是Hcy重新甲基化的关键酶，可将5，10-亚甲基四氢叶酸还原为5-甲基四氢叶酸，参与机体的生理生化过程，而编码MTHFR 的基因存在多种突变，其中最常见的为MTHFR C677T 位点基因多态性［5-6］。MTHFR C677T 位点的突变中677 位点上的C→T 突变是最常见的一种，这种突变导致丙氨酸被缬氨酸取代，使MTHFR 基因热稳定性及活性下降。

有研究表明，MTHFR C677T 位点的CT 杂合突变型MTHFR 活性为CC 型MTHFR 的65%，而TT纯合突变型的活性仅为正常值的30%［7］。还有研究显示，我国MTHFR 基因的C677T 位点基因变异频率具有地区差异，从南向北随纬度的增加，TT 型的比例逐渐升高，MTHFR C677T 中TT 基因型的分布从北方到南方逐渐降低，如山东省（40.8%）、湖北省（16.8%）、海南省（6.4%）［8］。本研究中山西太原地区脑卒中患者MTHFR C677T 位点TT 基因型的分布频率（32.6%）与陕西省（30.4%）相似，有学者调查结果显示，MTHFR C677T 位点基因型对脑卒中的影响与地区和饮食习惯有关，对于膳食摄入叶酸较为充足地区的人群，即使发生MTHFR C677T 位点基因突变也并未增加脑卒中风险［9］。

一项涉及72 个研究，纳入将近3 万例患者的荟萃分析也显示，MTHFR C677T 位点基因多态性与脑卒中发病有关，T 突变导致增加了至少30%的缺血性卒中发生［10］。MTHFR 的活性降低会导致血清Hcy 水平升高，从而使缺血性卒中风险增加［11］。由于Hcy 浓度是脑卒中一个可改变的危险因素，检测血清Hcy 水平是判断脑卒中严重程度及预后的简单易行且有意义的重要指标。

本研究显示，山西太原地区健康体检者MTHFR C677T 位点的高度风险TT 基因型占比为32.6%，脑卒中患者的TT 基因型占比为49.0%；对照组和脑卒中组MTHFR 1298C 基因的高度风险CC 基因型频率比较差异有统计学意义；MTRR A66G 基因型的高度风险基因GG 对照组占比7.2%，脑卒中组占比12.3%；对照组和脑卒中组的TT、CC、GG 基因型频率比较差异有统计学意义。本研究中血清Hcy水平CT 基因型在低Hcy 组分布频率较高，而TT 基因型在高Hcy 组分布频率较高，且频率随着Hcy 水平升高而增加。脑卒中患者MTHFR 基因多态性高风险基因型与高Hcy 水平有关，但不足之处是回顾性临床研究混杂选择偏倚、样本量偏少等，还需要前瞻性、大规模随机对照研究以进一步证实［12-13］。

Hcy 水平高低主要受体内叶酸水平以及叶酸代谢酶活性的影响，尤其是MTHFR。MTHFR 基因C677T 位点多态性是导致叶酸利用能力下降，Hcy水平升高最常见的基因变异原因。有研究证实，脑卒中患者携带MTHFR C677T 位点高风险TT 基因型的比例明显高于携带CC 和CT 基因型的患者，MTHFR 基因突变合并高同型半胱氨酸血症可使脑卒中的发生风险增加5.18 倍。除MTHFR 的影响外，体内Hcy 水平还受到MTRR 的影响。MTRR A66G位点基因多态性可导致MTHFR 的活性表达出现差异，影响代谢通路，从而导致代谢通路受阻，引发高同型半胱氨酸血症。MTHFR 和MTHF 基因多态性会影响酶活性，从而改变体内叶酸代谢，导致机体发生多种疾病。中国脑卒中一级预防研究（Chinese Stroke Primary Prevention Study，CSPPT）显示，补充叶酸可使高血压患者的首次卒中风险降低21%，其中MTHFR C677T 位点携带CC 和CT 基因型的患者补充叶酸可使卒中风险降低15%，TT 基因型风险降低30%。因此，补充叶酸的合理剂量是降低Hcy 水平最直接有效的方法。

综上所述，脑卒中发生的遗传因素可能包括多种Hcy 代谢酶相关基因的突变，而血Hcy 水平变化也受到遗传因素（如相关代谢酶基因突变）和环境因素共同影响，山西地区居民的饮食主要以富含B族维生素和叶酸的谷物为主，占能量摄入的78%。有研究显示，摄入B 族维生素能够预防和降低脑卒中的发生概率［14］。但是由于气候条件和饮食习惯的影响，该地居民对绿色蔬菜水果的摄入不足，因此要重视MTHFR 基因多态性与Hcy 水平的检测结果，合理补充和摄入叶酸，才能有效预防脑卒中的发生［15］。临床应针对基因突变合并高Hcy 患者从多方面干预，降低脑卒中发生的风险。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突