柑桔黄龙病菌在年桔病树枝条和果实桔络内的分布规律

吕若亚，李 云，郑永钦，邓晓玲，郑 正

(华南农业大学柑桔黄龙病研究室，广州，510642)

柑桔黄龙病是我国华南柑桔产区最严重的病害，可为害几乎所有的商业栽培品种，且目前暂无有效的抗耐品种可供生产应用[1]。广东潮州、潮汕等地的果园均发现有黄龙病[2-4]。柑桔染病后，出现叶片斑驳黄化、“红鼻子果”或青果等症状，植株寿命缩短，果实产量和品质严重下降[1，4]。虽然黄龙病是系统侵染性病害，但黄龙病菌在染病柑桔植株中分布不均匀，且因柑桔品种和患病程度不同而有所差异[5-10]。有研究表明，贡柑病株主叶脉中黄龙病菌(“CandidatusLiberibacter asiaticus”，CLas)的含量最高[11]。但亦有研究显示，沙糖桔和贡柑等多种柑桔的果实中CLas呈富集状态，且同一果实不同部位中CLas的含量存在显著差异[9-10]。

年桔(Citrushaniana‘Nianju’)在我国栽培历史悠久，是广东地区的名特优水果。广东省惠州市龙门县是我国年桔的重要产地和主产区之一[12]。近年来，柑桔黄龙病在龙门年桔产区流行发生，造成了严重的经济损失[12-13]。本研究采用定量Real-time PCR技术对染病年桔枝条及果实中CLas的分布进行系统分析，为探究CLas在年桔植株中的转运规律提供参考。

1 材料与方法

1.1 染病材料采集2021年12月在广东省惠州市新天地果场，选取10株感染黄龙病(表现叶片斑驳黄化或“红鼻子果”)的年桔(8年生)，从每株树采集一个带果小枝组进行检测。分为当年生叶、当年生枝、果蒂、桔络、果实中心柱、2年生及以上枝等6个部分(图1)。

注：1：当年生叶；2：当年生枝；3：果蒂；4：果实中心柱；5：桔络；6：2年生及以上枝。

从田间采集的每株病树的病果中各选取一个果径较大、症状较明显的果实用于桔络的采集。每个果实用灭菌镊子挑取一条较长的桔络(≥4.5 cm)，从上(果蒂部)至下(果顶部)将每条桔络切成长度为1.5 cm的若干段，切至最后一段桔络时，若其长度<1 cm则与上一段合并，若1 cm<长度<1.5 cm则自成一段。其中，从果蒂端起长1.5 cm的片段记为前端片段，此后每1.5 cm长的片段依次记为中端片段、中后端片段和后端片段。

1.2 DNA提取使用OMEGABIO-TE公司的植物DNA提取试剂盒HP Plant DNA Kit(2485-02)提取植物总DNA，用Qubit 4.0核酸定量仪(Thermo Fisher Scientific)进行检测，并在-20 ℃保存备用。

1.3 定量Real-time PCR检测采用Bao等[14]方法进行CLas定量Real-time PCR检测。反应体系(20 μL)包括引物CLas-4G和HLBr(10 μmol/L)各0.4 μL，HLBp探针(0.5 μmol/L)0.2 μL，PerfectStart®II Probe qPCR SuperMix (TransGen Biotech Co.，Beijing)10 μL，DNA模板1.0 μL，ddH2O 8 μL。反应程序为95 ℃ 5 min→[(95 ℃ 10 s→58 ℃ 30 s)，40个循环]。Ct值>32表示该样品为黄龙病阴性，Ct值≤32表示该样品为黄龙病阳性。

使用含有引物CLas-4G/HLBr扩增片段的pEASY-T1(TransGen Biotech Co.，Beijing)重组质粒构建标准曲线。初始的质粒浓度使用Qubit 4.0核酸定量仪(Thermo Fisher Scientific)进行测定，并计算拷贝数。质粒拷贝数=(阿伏伽德罗常数×质粒浓度)/(重组质粒碱基对长度×1×109×650)，阿伏伽德罗常数为6.022 × 1023，浓度单位为ng/μL。通过Real-time PCR得出的标准化方程(y= -3.706x+43.82，R2=0.995)，对每个样品自动进行拷贝数的换算。同一枝条不同部位中的 CLas 浓度以每 ng DNA 含有的CLas拷贝数来表示。同一桔络不同片段中CLas的含量总数=每μL DNA中CLas的拷贝数×总提取的DNA体积(本研究提取的桔络组织DNA均定容为60 μL)。

1.4 数据分析用SPSS 18.0软件中的单因素方差分析，比较CLas含量差异。

2 结果与分析

2.1 CLas在不同部位的分布试验测定结果看出，果实部位的组织(包括果蒂、中心柱和桔络)均能检测到CLas，韧皮部有80%能检测到CLas，当年生叶仅40%能检测到CLas；CLas在桔络中的丰度显著(p<0.05)高于其他部位，其他部位组织中的CLas丰度无显著(p>0.05)差异(表1)。说明，CLas在同一枝组上呈不均匀分布。

表1 感染黄龙病年桔带果实枝组不同部位黄龙病菌的定量分析结果

2.2 CLas在桔络中的分布通过对同一桔络每1.5 cm片段中的CLas含量进行定量比较分析，发现CLas在同一桔络中分布不均匀。中端片段的CLas含量最高，显著(p<0.05)高于前端片段和后端片段，前端片段和后端片段差异不显著(见图2)。

注：A：每段桔络中的CLas数量，方框表示每1.5 cm桔络片段。B：柱形图表示桔络片段中黄龙病菌数量的平均值，数柱上不同小写字母表示经邓肯氏新复极差法比较差异显著(p<0.05)。

3 讨论

年桔作为广东省优势柑桔品种，近年来受黄龙病影响严重，但有关年桔黄龙病的症状描述与病原相关研究较少。笔者观察发现，在发生典型“红鼻子果”症状的年桔枝条上叶片常易脱落，仅部分叶片表现为轻微斑驳、黄化，多数枝条上的叶片无明显症状。同时，相比于健康果实，感染黄龙病的年桔果实除呈“红鼻子果”症状外，还表现出畸形、小果及种子败育。本研究通过定量分析发现，CLas在染病年桔枝条(组)中的分布不均匀，且以果实桔络中的含量最高。这与染病贡柑、沙糖桔等多个品种枝条中的CLas分布规律相似[9-10，15]。早期研究发现，CLas可通过筛孔随营养流的方向从“源”器官(如成熟叶片等)移动到“库”器官(如果实等)[5，16]。本研究采集年桔枝条(组)的时间为果实转色中期(12月)，果实积累了从叶片等源器官输送的大量营养物质和CLas。桔络作为果实中输送营养物质的维管束组织[17]，亦可为CLas的增殖提供大量营养，这进一步解释了桔络含有较高CLas丰度的原因。本研究的结果还显示，同一年桔果实的桔络，以中端片段的CLas含量最高，前端片段和后端片段差异不显著。前期研究发现，感染黄龙病的尤力克柠檬、温州蜜柑和葡萄柚果实，其桔络中端或后端的CLas含量要高于前端[15]。这可能与桔络自身的结构，以及病株中淀粉沉积和维管束堵塞，影响了CLas在桔络中的移动和分布有关。