百香果茎基腐病病原鉴定及室内毒力测定

陈 圆，赵志祥，严婉荣，王海洪，吉训聪

(海南省农业科学院植物保护研究所/海南省农业科学院农产品质量安全与标准研究中心/海南省植物病虫害防控重点实验室/农业农村部海口作物有害生物科学观测实验站，海口，571100)

百香果又名鸡蛋果、西番莲，是一种热带水果，营养丰富，具有“饮料之王”的美称[1]。近年来，随着百香果种植面积不断扩大，未经检疫或消毒的苗木大量进入市场，百香果病害发生越来越多，主要有茎基腐病和病毒病。调查发现，茎基腐病的发病率为14%，致死率为5%[2]，是一种毁灭性病害。据研究报道，引起百香果茎基腐病的病原有多种，包括腐皮镰孢菌Fusariumsolani(Mart) Sacc[2-4]、尖孢镰刀菌F.oxysporumSchlecht[5]、疫霉菌PhytophthoranicotianaeBreda de Haan[6]、轮纹镰刀菌F.concentricum[7]，毛色二孢属(Lasiodiplodia)、黑孢属(Nigrospora)、刺盘孢属(Colletotrichum)、新拟盘多毛孢属(Neopestalotiopsis)、假拟盘多毛孢属(Pseudopestalotiopsis)、拟茎点霉属(Phomopsis)和漆斑菌属(Myrothecium)等病菌[8]。宋晓兵等[3]结合病原菌形态学特征、致病性测定及rDNA ITS序列分析，鉴定广东省西番莲茎基腐病的病原菌为腐皮镰孢菌F.solani。郑加协等[5]研究认为西番莲茎基腐病的病原为尖孢镰刀菌F.oxysporum。詹儒林等[6]从海南省琼海市西番莲上分离出茎基腐病原物，鉴定为疫霉菌P.nicotianae。然而，引起海南西番莲茎基腐病的病原是否有其他种真菌，或多个种真菌复合侵染，目前鲜见文献报道。

百香果茎基腐病的药剂防治研究发现，65%代森锌和80%多菌灵田间防效较好，药后90 d防治效果分别可达70.83%和62.5%[9]。室内毒力测定发现，丙环唑[10]，45%咪鲜胺水乳剂、10%苯醚甲环唑水分散粒剂和43%戊唑醇悬浮剂[11]，咯菌腈和异菌脲[12]，以及甲基托布津和扑海因对镰刀菌菌丝生长或孢子萌发都有一定的抑制效果[13]。为了寻找更多对百香果茎基腐病有效的防治药剂，以便生产中轮换用药，减少抗药性的发生，本研究对海南省澄迈县百香果茎基腐病病原菌进行鉴定，并测定6种药剂对病原菌的室内毒力，旨在为百香果茎基腐病的防治提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

从海南省澄迈县永发百香果基地收集病样，参考方中达等[14]的方法分离病菌备用。药剂包括250 g/L丙环唑乳油，陕西恒润化学工业有限公司产；250 g/L苯醚甲环唑乳油，浙江禾本科技有限公司产；450 g/L咪鲜胺水乳剂，湖南万家丰科技有限公司产；70%甲基硫菌灵可湿性粉剂，江苏龙灯化学有限公司产；500 g/L嘧菌酯悬浮剂，江苏瑞邦农药厂有限公司产；30%噁霉灵水剂，四川润尔科技有限公司产。培养基包括PDA，马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂粉20 g，蒸馏水1 000 mL，pH值6.8～7.0；PCA，马铃薯20 g，胡萝卜20 g，琼脂粉20 g，蒸馏水1 000 mL。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分离纯化 采用组织分离法，将茎基部病健交界处剪成小块，70%酒精浸泡10 s，1%升汞浸泡1 min后，置于PDA平板中培养纯化，并命名baiLD，4 ℃冰箱中保存备用或直接用于致病力测定和鉴定试验。

1.2.2 形态鉴定 用接种针挑取菌丝到1 000倍显微镜下观察菌丝、分生孢子及分生孢子梗的形态。

1.2.3 致病性测定 纯化后的病原菌镜检到分生孢子后，用无菌水冲洗分生孢子，制成1×107个/mL孢子悬浮液浇灌百香果苗，每株50 mL，以浇灌清水为对照，每重复3株，重复3次，接种后30 d观察其发病症状是否与病样症状一致。

1.2.4 分子鉴定 将纯化病菌baiLD寄送北京六合华大基因科技有限公司进行ITS区测序分析和分子鉴定，测序得到544 bp的ITS序列，将其在NCBI中进行Blast比对，下载相似性较高的ITS序列，以胶孢炭疽菌F210235 (登录号：KX197394)为外源参照序列，采用MEG X[7]软件邻近距离法构建系统进化树，分析系统进化发育关系。

1.2.5 药剂配制 药剂配制参考陈圆等[16]的方法。经预试验测试，将供试药剂浓度设计为：250 g/L丙环唑乳油25、31.25、62.5、125、250 mg/L，250 g/L苯醚甲环唑乳油25、31.25、62.5、125、250 mg/L，450 g/L咪鲜胺水乳剂9、45、90、450、500 mg/L，70%甲基硫菌灵可湿性粉剂87.5、175、350、700、1 400 mg/L，500 g/L嘧菌酯悬浮剂62.5、125、250、500、1 000 mg/L，30%噁霉灵水剂37.5、75、150、300、600 mg/L。

1.2.6 药剂毒力测定 菌丝生长速率法[15]：将煮沸的PDA分装到三角锥瓶中，每瓶49 mL，高压灭菌后，分别加入各浓度药液1 mL，再分别倒入直径9 cm培养皿中，每皿约16 mL，制成含药培养基，每种药剂5个浓度处理，每个处理重复3次，以加等量无菌水的PDA平板为对照。用直径0.5 cm打孔器在病原菌菌落边缘取适量菌饼，菌面朝下接入含药和对照平板中央，放入28 ℃生化培养箱培养，7 d后用十字交叉法测量各处理的菌落直径，计算供试药剂对病原菌菌丝的相对抑制率。相对抑制率(%)=(对照菌落平均增长直径-药剂处理菌落平均增长直径)/对照菌落平均增长直径×100。

孢子萌发法[16]：将1×107个/mL孢子悬浮液各取1 mL放入无菌培养皿中，倒入温度50 ℃左右灭菌PDA制成分生孢子平板，然后用灭菌的直径0.5 cm滤纸片从低浓度到高浓度蘸取供试药剂药液，以蘸取无菌水的滤纸片为对照，置于分生孢子平板中，每皿1片，每个处理重复3次，7 d后用十字交叉法测量各处理的抑菌圈直径，计算相对抑制率。相对抑制率(%)=处理抑菌圈直径/培养皿直径×100。

2 结果与分析

2.1 病菌形态

分离获得的病菌属真菌界半知菌类，菌丝透明，具分隔，在侧生的孢子梗上着生分生孢子。大型分生孢子镰刀形，略弯，两端稍尖，具隔膜2～5个，多为3个，大小(22.6～37.4) μm×(2.5～4.2) μm，足胞明显(见图1)。

图1 分离获得的百香果茎基腐病病菌PDA培养和分生孢子形态

2.2 病菌致病性测定

试验发现，接种病菌的9株百香果苗有7株发病，发病率约为78%，其中2株未发病可能由于百香果苗品种差异引起；对照未发病。发病株枯萎，茎基部变褐坏死，与病样症状一致，符合柯赫氏法则，重新组织分离纯化后得到同样病原菌，命名为baiLD。

2.3 分子鉴定

将病菌baiLD ITS序列在NCBI中BLAST比对，得到相似性较高的多条ITS序列。与腐皮镰刀菌FusariumsolaniSY1(登录号：MT605584)、FD1(登录号：MN015032)、W5-3(登录号：MK764995)、BLH-W1(登录号：MG836251)、MR29(登录号：MW509863)的ITS序列相似性为100%；与尖孢镰刀菌Fusariumoxysporumisolate FOM-12(登录号：MN272279)和尖孢镰刀菌辣椒专化型Fusariumoxysporumf. sp.ciceris(登录号：KU097320)ITS序列相似性为84.6%；与层生镰刀菌Fusariumproliferatum菌株RS_79(登录号：MK332493)和Fusariumproliferatum菌株CanR-8(登录号：JF817300) 序列相似性为83.27%。从系统进化树可以看出，菌株baiLD与镰刀菌属多条序列聚在1个大的分支上，结合形态学特征，确定菌株baiLD为腐皮镰刀菌Fusariumsolani(见图2)。

图2 百香果茎基腐病病菌baiLD基于ITS基因系统进化树

2.4 室内毒力测定

试验结果看出，250 g/L苯醚甲环唑乳油的EC50最小，为0.337 2 mg/L，其次是450 g/L咪鲜胺水乳剂，其EC50为0.474 9 mg/L，再次是70%甲基硫菌灵可湿性粉剂，其EC50为0.7 172 mg/L；而450 g/L咪鲜胺水乳剂的EC90为1.210 2 mg/L，远远低于其他药剂的EC90值。结合回归曲线来看，斜率越大，病菌对该药剂的敏感性差异越小[17]，因此，450 g/L咪鲜胺水乳剂对百香果腐皮镰刀菌的毒力最强(见表1和图3)。

表1 6种药剂对百香果腐皮镰刀菌Fusarium solani菌丝生长的毒力比较

咪鲜胺水乳剂9 mg/L对分生孢子的抑制效果最好，抑菌圈直径最大，为6.23 cm，相对抑制率为74.78%；其4.5 mg/L的抑制效果次之，相对抑制率为61.44%；70%甲基硫菌灵可湿性粉剂1 400 mg/L的抑菌圈直径较大，为4.8 cm，相对抑制率为58.89%。250 g/L苯醚甲环唑乳油处理浓度中，250 mg/L的相对抑制率最大，为33.67%；而丙环唑乳油250 g/L处理的相对抑制率最高，30%噁霉灵水剂37.5～600 mg/L对病菌分生孢子无抑制作用。试验发现450 g/L咪鲜胺水乳剂处理的病菌分生孢子抑菌圈界线清晰，药剂持效期较长(见表2和图3)。

图3 3种药剂对百香果腐皮镰刀菌菌丝和分生孢子生长(右下)的抑制作用

表2 6种药剂对百香果腐皮镰刀菌Fusarium solani分生孢子的抑制作用比较

3 结论与讨论

百香果种植周期短，收益快，海南省各(市)县百香果种植面积逐年增加，百香果产业在海南省脱贫攻坚和乡村振兴中发挥着重要作用。茎基腐病是海南省百香果生产的主要病害，成为制约海南省百香果产业进一步扩大的关键因素。本研究对海南省澄迈县百香果茎基腐病样病原菌进行了分离纯化，结合田间症状、形态特征观察、致病性测定、ITS序列和系统发育分析，鉴定为腐皮镰刀菌Fusariumsolani。这与林泗海等[2]的研究报道一致，而与詹儒林等[6]报道的海南省琼海市西番莲茎基腐病病原菌不同，说明海南省百香果茎基腐病的病原菌不唯一，有可能是多种病原菌复合侵染所致。室内毒力测定中，百香果腐皮镰刀菌对450 g/L咪鲜胺水乳剂和70%甲基硫菌灵可湿性粉剂较敏感，尤其是450 g/L咪鲜胺水乳剂，其对百香果腐皮镰刀菌丝和分生孢子都有较强的抑制作用，可进一步用于大田试验。供试药剂EC50仅作为百香果镰刀菌的室内毒力参考，不能直接应用于田间，供试6种药剂在田间防治效果有待进一步研究。