广西地区不同胎龄早产儿氨基酸和肉碱切值的建立*

林彩娟, 耿国兴, 黄小桃, 吴柳霖, 徐钰琪, 李威, 钱家乐, 罗静思

广西壮族自治区妇幼保健院(广西出生缺陷预防控制研究所)遗传代谢中心实验室、广西生殖健康与出生缺陷防治重点实验室、广西新生儿疾病筛查中心(广西南宁 530012)

早产儿是指胎龄未满37周的新生儿，每年在世界范围内有1 200万至1 300万人次出生，占分娩总数的5%～15%[1]。早产儿与足月儿相比,无论是体格发育、器官成熟度、营养消化吸收能力及内环境均存在差异,为降低早产儿并发症的发生,降低病死率,需及早进行相关遗传代谢病(IMD)检测并密切监测和评估其营养成分的代谢能力。串联质谱技术(MS/MS)是对40余种氨基酸、有机酸及脂肪酸代谢病进行快速筛查和诊断的一项技术[2]。共识也明确指出早产儿属于新生儿筛查的特殊群体，从采血时间、采血地点、采血次数、信息登记、实验室检测、检测结果判断到阳性召回分析，与正常新生儿均有不同，需要在新生儿筛查的各个环节引起重视，从而降低漏筛率、假阳性率及假阴性率[3]。本研究通过串联质谱技术回顾性分析了不同胎龄早产儿干血斑中的氨基酸和肉碱浓度水平并与足月儿进行比较，分别建立其切值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 回顾性选取2019—2021年于广西新生儿疾病筛查中心筛查片区出生并进行IMD筛查且经初筛、复查确定未患IMD的新生儿65 000例为研究对象，其中早产儿4 248例，足月儿60 752例。早产儿根据胎龄分为极早产组(胎龄<32 周，n=465)、中期早产组(32≤胎龄<34周,n=599)、晚期早产组(34≤胎龄<37 周,n=3 184)。本研究获得广西壮族自治区妇幼保健院伦理委员会的批准(桂妇保院医研伦快审[2020-1]59号)，且所有新生儿监护人均签署知情同意书。

1.2 标本采集 采集出生48 h后充分哺乳的新生儿足跟血，滴于S&S903专用采血滤纸片上，自然渗透、无污染、自然晾干后递送至广西新生儿疾病筛查中心实验室。

1.3 仪器、试剂与检验方法 串联质谱仪4500(AB SCIEX)，恒温孵育振荡器(PerkinElmer),非衍生化多种氨基酸、肉碱测定试剂盒(Wallac Oy)，检测方法按照非衍生化多种氨基酸、肉碱测定试剂盒说明书进行操作。

1.4 检测指标

1.4.1 氨基酸11种 瓜氨酸(citrulline,Cit)、苯丙氨酸(phenylalanine,Phe)、蛋氨酸(methionine,Met)、酪氨酸(tyrosine,Tyr)、丙氨酸(alanine,Ala)、缬氨酸(valine,Val)、亮氨酸(leucine,Leu)、精氨酸(arginine,Arg)、鸟氨酸(ornithine,Orn)、甘氨酸(glycine,Gly)、脯氨酸(proline,Pro)。

1.4.2 肉碱31种 游离肉碱(free carnitines,C0)、乙酰基肉碱(acetyl carnitine,C2)、丙酰基肉碱(propionyl carnitine,C3)、丙二酰肉碱+3-羟基丁酰肉碱(malonylcarnitine+3-hydroxybutyrylcarnitine,C3DC+C4OH)、丁酰基肉碱(butyrylcarnitine,C4)、甲基丙二酰基肉碱+3-羟基异戊酰基肉碱(methylmalonylcarnitine+3-hydroxyisovalerylcarnitine,C4DC+C5OH)、异戊酰基肉碱(isovaleroylcarnitine,C5)、异戊烯酰基肉碱(isopentenylcarnitine,C5:1)、戊二酰基肉碱+3-羟基己酰基肉碱(glutarylcarnitine+3-hydroxyhexanoylcarnitine,C5DC+C6OH)、己酰肉碱(hexanoylcarnitine,C6)、己二酰肉碱(adipylcarnitine,C6DC)、辛酰基肉碱(capryloylcarnitine,C8)、辛烯酰基肉碱(octenoylcarnitine,C8:1)、葵酰肉碱(decenoylcarnitine,C10)、葵烯酰肉碱(decenoylcarnitine,C10:1)、葵二烯酰肉碱(kuwaidi dienoylcarnitine,C10:2)、月桂酰肉碱(lauroylcarnitine,C12)、月桂烯酰肉碱(lauroylcarnitine,C12:1)、肉豆蔻酰肉碱(myristoylcarnitine,C14)、肉豆蔻烯酰肉碱(myristoylcarnitine,C14:1)、肉豆蔻二烯酰肉碱(myristoylcarnitine,C14:2)、3-羟基肉豆蔻酰肉碱(3-hydroxymyristoylcarnitine,C14OH)、棕榈酰肉碱(palmitoylcarnitine,C16)、棕榈烯酰肉碱(palmitoylcarnitine,C16:1)、3-羟基棕榈酰肉碱(3-hydroxypalmitoylcarnitine base,C16OH)、3-羟基棕榈烯酰肉碱(3-hydroxypalmitenoylcarnitine,C16:1OH)、十八碳酰肉碱(octadecyloylcarnitine,C18)、十八碳烯酰肉碱(octadecyloylcarnitine,C18:1)、十八碳二烯酰肉碱(octadecyloylcarnitine,C18:2)、3-羟基十八碳酰肉碱(3-hydroxyoctadecenoylcarnitine,C18OH)、3-羟基十八碳烯酰肉碱(3-hydroxyoctadecenoylcarnitine,C18:1OH)。

1.5 统计学方法 采用SPSS 19.0统计软件对检测数据进行分析，采用Kolmogorov-Smirnov检验判断数据的正态性，偏态分布资料根据《新生儿遗传代谢病筛查指标切值建立方法专家共识》[4]选用中位数(M)百分位数法第99.5百分位值与第 0.5百分位值(P0.5～P99.5)建立参考区间，多组间比较采用 Kruskal-WallisH检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 数据正态性检验 经Kolmogorov-Smirnov检验判断数据的正态性，不同胎龄早产组及足月对照组结果显示11种氨基酸和31种肉碱检测结果均为P<0.05，均不符合正态分布，结果见表1。

表1 早产儿和足月儿氨基酸及肉碱水平的正态性检验 μmol/L

2.2 不同胎龄早产组和足月对照组氨基酸和肉碱切值水平 本研究数据采用百分位数法(P0.5，P99.5)统计得出不同胎龄早产儿组及足月对照组干血斑中11种氨基酸和31种肉碱切值，经 Kruskal-WallisH检验发现早产儿不同胎龄组与足月对照组氨基酸和肉碱均有统计学意义(P<0.05)，在所检测的11种氨基酸中不同胎龄早产组参考区间上下限Ala、Orn、Gly、Pro均低于足月对照组，而Arg均高于足月对照组；31种肉碱中不同胎龄早产组参考区间上下限C6DC、C16、C16:1OH、C18、C18:1均低于足月组，C4DC+C5OH、C5、C5:1、C8、C8：1、C10:2、C14:2、C14OH、C18:2高于足月组，见表2。

表2 不同胎龄早产儿和足月儿氨基酸及肉碱切值水平 M(P0.5～P99.5)

3 讨论

串联质谱技术已被证明是新生儿IMD筛查的有效技术，并且适用于筛选多达50种的先天性代谢紊乱的检测，其中包括氨基酸代谢异常、脂肪酸氧化障碍以及有机酸代谢障碍等[5-6]。国内许多研究证实早产儿与足月儿的血氨基酸和酰基肉碱存在显著差异[7-8]，但各项研究对于每种氨基酸及酰基肉碱水平差异的描述仍不一致，可能与胎儿本身不同出生胎龄、体重、采血时间、器官发育、营养支持、疾病状态、治疗干预、地域环境等诸多因素有关[9-10]。不恰当、不合理的切值设定可能导致假阴性或者假阳性，造成临床判读的偏差[11]，因此制定适合自己实验室的切值对筛查结果的判读至关重要。早产儿与足月儿体内相关代谢酶成熟度存在差异，血液代谢物水平也有较大差异，检测结果可能过高或过低，故切值计算需要考虑胎龄因素，提高筛查特异度，尽量避免假阳性或假阴性[12]。本研究对4 248例早产儿和60 752例足月儿进行串联质谱检测，早产儿按不同胎龄进行分组，通过K-S检验，氨基酸和肉碱均呈偏态分布，根据《新生儿遗传代谢病筛查指标切值建立方法专家共识》[4]、《新生儿遗传代谢病筛查质量指标共识》[13]、《新生儿疾病串联质谱筛查技术专家共识》[14]选用第99.5百分位值与第 0.5百分位值分析不同胎龄早产儿氨基酸和肉碱的切值情况。

氨基酸指标方面，早产儿发育成熟度低，容易造成氨基酸过量或缺乏。本研究发现，不同胎龄早产儿与足月儿比较11种氨基酸水平均有差异(P<0.05)，不同胎龄早产组参考区间上下限Ala、Orn、Gly、Pro均低于足月对照组，而Arg均高于足月对照组，与既往研究[15]基本一致。不同胎龄早产组Ala、Orn、Gly、Pro水平均低于足月对照组，可能是早产儿的胎盘氨基酸转运功能受损或氨基酸合成能力不足及低效率的营养吸收导致[16]。精氨酸具有扩张组织血管，维持血流通畅并调节机体免疫反应的作用，本研究中不同胎龄早产儿组血液中Arg均高于正常足月儿可能与早产儿体内应激调节有关[17]。

肉碱分为两类，即游离肉碱和酰基肉碱，是细胞内能量代谢的必须物质。杨宇奇等[18]研究表明，早产儿游离肉碱和酰基肉碱水平不同于足月儿，易造成新生儿疾病筛查的假阳性率升高，建议结合胎龄建立新生儿游离肉碱和酰基肉碱参考范围。本研究显示，不同胎龄早产儿与足月儿比较31种肉碱水平均有差异(P<0.05)。其中C6DC、C16、C16:1OH、C18、C18:1不同胎龄早产组参考区间上下限均低于足月组，而C4DC+C5OH、C5、C5:1、C8、C8：1、C10:2、C14:2、C14OH、C18:2高于足月组，该结论与国内董丽萍等[19]文献报道的结论部分相符，对于存在不同差异性的其他酰基肉碱,这可能与人群、地区差异、实验方法及早产儿的营养支持不同等情况相关。

综上所述，早产儿氨基酸和肉碱水平与出生胎龄密切相关,为提高早产儿氨基酸、脂肪酸和有机酸代谢障碍性疾病筛查的准确性,分别建立不同胎龄早产儿氨基酸和肉碱的参考区间作为实验室暂定切值。由于本研究收集到的早产儿样本尤其是极早产和中期早产儿数量有限，在今后的工作中，随着筛查量的不断增加，将进一步调整及优化不同胎龄早产儿氨基酸和肉碱的切值，以最大程度地降低假阳性提高阳性预测值，为早产儿遗传代谢性疾病的筛查及诊断提供更精准的科学依据，也为早产儿营养治疗和监测提供参考依据。

利益相关声明：所有作者均声明不存在任何利益冲突。

作者贡献说明：林彩娟是本研究的实验设计者和实验研究的执行人，完成数据统计分析，论文撰写；耿国兴负责实验设计及数据分析；黄小桃、吴柳霖负责实验；徐钰琪、李威负责实验资料收集；钱家乐负责实验数据审核；罗静思负责指导及论文修改。