电针耳迷走神经对断奶前母本隔离模型小鼠焦虑、抑郁样行为的影响

吴 楠，王 强，2，3，李永丰，2，3，吴宇蔚，2，3，乔海法，2，3，李国徽，4*，袁 伟，2，3*

1 陕西中医药大学针灸推拿学院，陕西 咸阳 712046；

2 陕西省针药结合重点实验室，陕西 咸阳 712046；

3 咸阳市神经生物学（针灸）重点实验室，陕西 咸阳 712046；

4 宁夏医科大学附属银川市中医医院，宁夏 银川 750010

抑郁症是以持续的情绪低落、兴趣减退、失眠等为主要临床表现的疾病［1］。世界卫生组织调查数据显示，近年来抑郁症的患病率呈上升趋势，抑郁症已经成为危害人类健康的主要疾病之一［2］。有研究发现，抑郁症在发病年龄上呈现出年轻化趋势，青少年抑郁症的患病率为5%～8%［3］，成为威胁青少年身心健康的主要疾病之一，其高患病率给患者及其家庭、社会都带来了巨大的影响。由于儿童或青少年正处于生长发育的特殊阶段，传统单胺神经递质类药物以及选择性5-羟色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）再摄取抑制剂类药物的疗效欠佳且具有一定的局限性。研究显示，电针治疗抑郁症具有良好疗效［4］，且具有安全、经济、毒副作用小等优势，在情志类疾病的治疗中应用较为广泛。迷走神经耳支主要分布于耳甲区，治疗抑郁症时常将其作为针刺部位［5］，但其具体作用机制尚不完全清楚。

有研究表明，5-HT和抑郁症关系密切［6］，而色氨酸羟化酶（tryptophan hydroxylase，TPH）是合成神经递质5-HT过程中重要的酶，其中TPH2主要表达于脑干中缝神经元和肠道肌肠层神经元，是5-HT神经元的特异性标志物之一。中缝背核（dorsal raphe nucleus，DRN）中有大量5-HT神经元的表达［7］，其活性水平降低会影响5-HT系统的稳定性，导致个体情绪的异常［8］。此外，压力能显著影响前额叶皮层（prefrontal cortex，PFC）的神经元活性，特别是早期生活压力能显著影响个体的行为及神经发育，严重影响其情绪，甚至可能诱发抑郁症［9-10］。但是，电针耳迷走神经是否能改变DRN、PFC的脑区活性和DRN脑区的5-HT神经元数量，从而缓解焦虑、抑郁样行为尚不清楚。本研究采取断奶前母本隔离（preweaning maternal separation，PMS）C57BL/6小鼠模型模拟儿童抑郁症，观察电针耳迷走神经对PMS诱发的焦虑、抑郁样行为的影响及其可能的作用机制，为电针耳迷走神经治疗青少年抑郁症提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

本实验采用SPF级C57BL/6小鼠的繁殖子代鼠，繁殖鼠购自西安交通大学医学院动物中心，鼠龄7～8周，体质量（20±2）g，实验动物生产许可证号：SCXK（陕）2018-001。饲养环境均为恒定湿度（50±10）%，恒定温度（22±2） ℃，12 h昼夜交替照明（光照时间8：00—20：00），自由获取食物和水。实验过程严格按照科技部《关于善待实验动物的指导性意见》《陕西省实验动物管理办法》执行。

1.2 主要试剂与设备

原癌基因蛋白（c-fos）抗体（美国Cell Signaling Technology公 司，生 产批 号：2250S）；TPH2抗 体（美国Cell Signaling Technology公司，生产批号：33113ES60）；Alexa Fluor 647山羊抗兔荧光二抗（上海翊圣生物科技有限公司，生产批号：33113ES60）；多聚甲醛（国药集团化学试剂有限公司，生产批号：30625-89）；旷场实验箱、高架十字迷宫、悬尾测试箱（深圳市瑞沃德生命科技有限公司）；行为学记录分析系统（荷兰Noldus公司，型号：EthoVision）；韩氏电针仪（南京济生医疗科技有限公司，型号：HANS-200A）；冰冻切片机（美国Thermo Scientific公司，型号：HM525NX）；荧光显微镜（德国徕卡公司，型号：

S220）。

1.3 实验动物分组和模型制备

将3只成年C57BL/6雄鼠与9只成年C57BL/6雌鼠随机合笼（雄雌比1∶3），待雌鼠受孕后采用随机数字表法分为对照组和母本隔离组，对照组常规饲养，正常提供食物和饮水。母本隔离组在造模完成后，其子代采用随机数字表法分为模型组和电针组，每组10只。母本隔离组的母鼠生产后，母本正常照顾至出生第13天，从第14天开始每天将母鼠移出居住笼4 h，留幼仔单独居住，4 h后将母鼠移回居住笼，直至21 d断奶，通过旷场、高架十字迷宫测试来确定母本隔离模型制备是否成功［11］。

1.4 干预方法

模型建立后，电针组在异氟烷麻醉下进行电针干预。采用0.25 mm×13 mm不锈钢针灸针进行针刺，平刺2 mm，针刺穴位参照《常用实验动物针灸穴位图谱及穴位》取双侧耳甲区，电针过程采用连续波，频率2 Hz，强度1 mA，1次/d，10 min/次，6 d/疗程，共干预2个疗程。对照组、模型组参照电针组进行麻醉束缚，但不进行电针干预。

1.5 观察指标

1.5.1行为学检测 干预完成后采用旷场测试、高架十字迷宫测试、悬尾测试等方法对各组小鼠进行行为学测试。

1.5.1.1旷场测试 在旷场测试前2 h将小鼠放在行为测试房中适应环境，此后，将小鼠置于旷场实验箱（40 cm×40 cm×40 cm）中进行旷场测试。小鼠头部固定朝向同1个方向，自由活动10 min并记录小鼠总移动距离及中心区域时间百分比。

1.5.1.2高架十字迷宫测试 在高架十字迷宫测试前2 h将小鼠放在行为测试房中适应环境，此后，将小鼠置于高架十字迷宫［2条开臂（30 cm×8 cm）、2条闭臂（30 cm×6 cm×15 cm）、中心区域（8 cm×8 cm）、距地面高度55 cm］中进行高架十字迷宫测试。小鼠头部正对一侧开臂方向，自由活动10 min，记录小鼠在开臂花费时间、开臂总移动距离及进入开臂次数。

1.5.1.3悬尾测试 在悬尾测试前2 h将小鼠放在行为测试房中适应环境，此后，将小鼠置于悬尾实验箱（30 cm×30 cm×50 cm）进行悬尾测试。将医用胶带粘贴在距离小鼠尾尖1 cm处并将小鼠悬挂在悬尾支架上，使小鼠鼻尖与设备台面距离约35 cm。使用摄像机记录小鼠6 min活动情况，对每只小鼠的活动时间进行统计分析。

每只小鼠完成以上3项测试后，均喷洒30%酒精去除小鼠在活动箱遗留的气味，防止对下1只小鼠实验结果造成干扰。

1.5.2脑组织c-fos及5-HT表达水平检测 在行为学测试结束后，将小鼠单独置于安静环境90 min后取材。通过腹腔注射过量乌来糖致小鼠安乐死，使用0.9% NaCl溶液对小鼠心脏进行灌注，灌注至肝脏和四肢发白，右心耳无血液流出，将输液管与4%多聚甲醛溶液连接。灌注完成后迅速将脑组织取出，置于4 %多聚甲醛溶液中固定24 h。将固定好的脑组织取出依次放入20%、30%蔗糖溶液中脱水，随后将脑组织放入包埋盒中，滴入包埋剂用冰冻切片机连续切片（40 μm），收集 PFC、DRN脑区备用。切片用磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）洗3次，每次10 min。使用含3‰ triton X-100的山羊血清封闭1 h，滴加c-fos（1∶1 000）和TPH2（1∶1 000）一抗4 ℃冰箱孵育过夜，孵育完成后使用PBS溶液洗3次，10 min/次，滴加Alexa Fluor 647荧光二抗（1∶400）室温孵育2 h，孵育完毕后使用PBS洗3次，10 min/次。4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）中孵育10 min，使用抗荧光淬灭封片剂封片，用荧光显微镜观察PFC、DRN脑区c-fos和DRN脑区5-HT的表达，并在相应脑区选择相同位置的典型区域（200 μm×200 μm）进行细胞数量统计。

1.6 统计学方法

采用SPSS 22.0统计软件进行数据分析。计量资料符合正态分布者，数据以（xˉ±s）表示；组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用Turky法。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 3组小鼠行为学指标比较

2.1.13组旷场实验行为比较 3组总移动距离和中心区域时间百分比比较，差异均具有统计学意义（P＜0.05）；与对照组比较，模型组总移动距离和中心区域时间百分比均明显降低，差异均具有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，电针组总移动距离和中心区域时间百分比均明显更高，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。见图1、表1。

图 1 3组小鼠旷场活动轨迹图Figure 1 Representative tracing of movement in the open field in three groups

表1 3组旷场测试检测指标比较（xˉ±s）Table 1 Comparison of detection indicators in open field in three groups （xˉ±s）

2.1.23组高架十字迷宫行为比较 3组开臂花费时间、开臂总移动距离及进入开臂次数比较，差异均具有统计学意义（P＜0.05）；与对照组比较，模型组开臂花费时间、开臂总移动距离及进入开臂次数均明显降低，差异均具有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，电针组开臂花费时间、开臂总移动距离及进入开臂次数均明显更高，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。见图2、表2。

表2 3组高架测试检测指标比较（xˉ±s）Table 2 Comparison of test indexes in the elevated maze in three groups （xˉ±s）

图2 3组高架十字迷宫活动轨迹图Figure 2 Representative tracing of movement in the elevated maze in three groups

2.1.33组悬尾测试行为比较 3组小鼠悬尾静止时间比较，差异具有统计学意义（P＜0.05）；与对照组比较，模型组悬尾静止时间明显增加，差异具有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，电针组悬尾静止时间明显更低，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见图3、表3。

图 3 3组悬尾测试热区图Figure 3 Heat maps in the tail suspension test in three groups

表3 3组悬尾测试指标比较（xˉ±s）Table 3 Comparison of suspension tail test indexes in three groups （xˉ±s）

2.2 3组DRN、PFC脑区c-fos表达水平比较

3组DRN、PFC脑区c-fos阳性神经元数量比较，差异均具有统计学意义（P＜0.05）；与对照组比较，模型组DRN、PFC脑区c-fos神经元数量均明显降低，差异均具有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，电针组DRN、PFC脑区c-fos神经元数量均明显更高，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。见表4、图4～5。

图4 3组小鼠DRN脑区c-fos表达（×20）Figure 4 Expression of c-fos in the DRN in three groups （×20）

表4 3组DRN、PFC脑区c-fos阳性细胞数量比较（xˉ±s）Table 4 Comparison of the number of c-fos positive cells in the DRN，PFC in three groups （xˉ±s）

图5 3组小鼠PFC脑区c-fos表达（×20）Figure 5 Expression of c-fos in the PFC in three groups （×20）

2.3 3组5-HT神经元数量比较

3组小鼠DRN脑区5-HT阳性神经元数量比较（P＜0.05）；与对照组比较，模型组DRN脑区5-HT神经元数量明显降低（P＜0.05）；与模型组比较，电针组DRN脑区5-HT神经元数量明显更高，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见图6、表5。

图6 3组DRN脑区5-HT神经元表达（×20）Figure 6 Expression of 5-HT neurons in the DRN in three groups （×20）

表5 3组DRN脑区5-HT神经元数比较（xˉ±s）Table 5 Comparison of the number of 5-HT neurons in DRN in three groups（xˉ±s）

3 讨 论

3.1 电针耳迷走神经可改善PMS模型小鼠焦虑、抑郁样行为

通过旷场和高架十字迷宫测试可以检测小鼠的焦虑样行为［12］，悬尾测试反映小鼠的抑郁样行为［13］。本研究结果显示，PMS可以减少C57BL/6小鼠在旷场测试中总移动距离、中心区域时间百分比；减少高架十字迷宫测试中开臂花费时间、开臂总移动距离及进入开臂次数；增加悬尾测试中悬尾静止时间。通过电针耳迷走神经干预后，电针组中心区域时间百分比和开臂花费时间均高于模型组，悬尾静止时间低于模型组，这提示电针迷走神经干预可改善PMS所致小鼠焦虑、抑郁样行为。这可能与以下因素有关：① 早期的生活经历与个体的行为及神经发育密切相关［14］，PMS可引起个体焦虑及抑郁样行为的发生，其作为一种慢性应激压力，诱发了小鼠焦虑、抑郁样行为的产生。抑郁症在中医学中属于“郁证”的范畴，情思忧虑会导致气行不畅，进而导致抑郁症的出现［15］。耳穴中心、神门穴等位于耳甲区，刺激以上穴位分区可改善气机郁滞，调整相应的脏腑功能。② 耳甲区分布着丰富的迷走神经，电针刺激耳甲区迷走神经，可影响迷走神经所属的副交感神经系统，令其与交感神经系统共同调节机体内分泌系统的功能，从而改善个体情志状态。

3.2 电针耳迷走神经改善PMS所致焦虑、抑郁样行为可能与调节c-fos及5-HT的表达有关

本研究结果显示，PMS可使小鼠PFC、DRN脑区的c-fos表达水平降低，DRN脑区5-HT神经元数量明显降低。电针耳迷走神经后，电针组PFC、DRN脑区c-fos表达水平明显上升，DRN脑区5-HT神经元数量明显升高，这提示电针耳迷走神经改善PMS所致焦虑、抑郁样行为可能与调节c-fos和5-HT的表达有关。这可能与以下因素有关：① 亲本照顾缺失作为一种早期生活压力对PFC、DRN脑区可产生持续性影响［16-17］，PMS小鼠PFC脑区活性、体积和厚度均明显减少［18］。电针刺激耳甲区可激活PFC脑区，促进神经元c-fos的表达，有利于受损神经元的修复，从而改善PMS小鼠抑郁样行为。这与FUCHIKAMI等［19-21］研究结果一致。② PMS小鼠DRN脑区5-HT神经元数量明显减少［22-24］，DRN脑区5-HT神经元可投射到前脑边缘区及大脑皮层，其神经元功能低下是抑郁症的病理、生理基础［25-26］。电针耳迷走神经干预后，TPH2的神经元表达水平提高，这提示电针刺激耳迷走神经使PMS小鼠5-HT神经元数量明显增加，DRN脑区5-HT系统趋于稳定，从而改善其焦虑、抑郁样情绪，这一改善可能依赖于调整5-HT相关受体的功能。其中，5-HT1A型受体（serotonin1Areceptor，5-HT1AR）是与抑郁症关系最密切的受体之一，在PFC脑区大量表达［27-28］。但其是否通过调控5-HT1A型受体以改善PMS诱发的焦虑、抑郁样行为尚不清楚，还需要下一步继续深入研究。

4 小 结

电针耳迷走神经可以改善PMS小鼠焦虑、抑郁样行为，其作用机制可能与改善c-fos表达水平，增加DRN脑区5-HT神经元的数量相关。