circMRPS35和KAT7在胃癌组织中的表达及预后评估价值*

黄灿坡，王 琳，林建泉，王建锋，张诚华

中国人民解放军联勤保障部队第910医院普外科，福建泉州 362000

胃癌是常见的胃肠道恶性肿瘤，全球每年因胃癌死亡病例高达73万[1]。胃癌早期症状不明显，许多患者发现时已为晚期，即使经过积极治疗，5年生存率仍不足30%[2-3]。环状RNA MRPS35(circMRPS35)是近年来发现的新的环状RNA(circRNA)，具有表达丰富、序列保守及较高的组织特异性的特点[4-5]。研究表明，circMRPS35能够通过调节突触融合蛋白3的表达，泛素化降解磷酸酶和张力蛋白同源物，进而促进肿瘤的恶性进展[6]。赖氨酸乙酰转移酶7(KAT7)具有组蛋白H4特异性乙酰转移酶活性，其在结直肠癌等恶性肿瘤中表达上调，通过表观遗传学修饰(如甲基化、乙酰化等)调控癌基因的表达，促进肿瘤的恶性增殖[7]。有研究发现，circMRPS35能够作为分子支架，招募KAT7至下游基因(如插头框O1基因)的启动子区域，调控肿瘤的增殖及转移[8]。本研究对胃癌组织中circMRPS35和KAT7的表达情况进行了检测，并探讨其在胃癌预后评估中的临床价值。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2016年2月至2019年2月本院诊治的88例胃癌患者为研究对象，其中男50例，女38例；年龄55～77岁，平均(62.3±5.1)岁；有淋巴结转移34例，无淋巴结转移54例；肿瘤最大径≤5 cm 54例，>5 cm 34例；肿瘤位置：位于胃底/胃体部者26例，位于幽门/胃窦部者62例；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期65例，Ⅲ期23例；分化程度：高/中分化48例，低分化40例。纳入标准：根据术后病理组织学检查结果明确诊断为胃癌(由2名病理科医师共同阅片确诊)；初诊患者，无肿瘤治疗史；患者精神状态良好，能够配合检查及治疗。排除标准：临床病理资料不完整；伴中重度脏器功能衰竭；合并胃肠道细菌感染性疾病。所有研究对象出院后定期随访，每3个月电话随访1次，连续随访3年，随访内容为患者生存情况，随访截止时间为2022年2月，随访终点为随访结束或患者死亡。本研究经本院医学伦理委员会审核通过。

1.2实时荧光定量PCR检测circMRPS35和KAT7 mRNA表达水平 应用实时荧光定量PCR检测患者胃癌组织及癌旁组织(距胃癌边缘2 cm以上)标本中circMRPS35和KAT7 mRNA的表达。应用RNAiso Plus试剂(日本，TaKaRa公司)提取组织总RNA，采用微量分光光度计检测RNA的浓度和纯度。使用PrimeScript RT Reagent Kit(日本，TaKaRa公司)将1 μg总RNA反转录为cDNA。使用SYBR Premix Ex Taq II(日本，TaKaRa公司)和ABI 7500 StepOne Plus系统(美国，Applied Biosystems公司)通过实时荧光定量PCR检测circMRPS35和KAT7 mRNA的表达。反应条件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 1 min，70 ℃ 30 s，35个循环。反应总体系为10 μL，包括模板1 μL，上、下游引物各1 μL，SYBR Premix 5 μL，去离子水2 μL。检测结果采用2-ΔΔCt法表示。引物序列见表1。

表1 引物序列

1.3免疫组织化学法检测KAT7蛋白表达 将胃癌及癌旁组织标本置于4%中性甲醛固定液中固定24 h，石蜡包埋后切片，烘箱60 ℃ 2 h烘干；二甲苯Ⅰ、Ⅱ脱蜡2次，每次10 min；梯度乙醇水化，每次5 min；采用高压锅法进行抗原热修复2 min，自然冷却；3% H2O2去除内源性过氧化物酶,室温下30 min；5%羊血清封闭30 min；一抗4 ℃孵育过夜 (兔抗人KAT7单克隆抗体购自Abcam公司，批号ab240315，稀释比为1∶500)；羊抗兔二抗37 ℃孵育1 h；辣根过氧化物酶标记的三抗37 ℃孵育30 min；二氨基联苯胺(DAB)显色5 min，苏木素复染1 min;梯度乙醇脱水，中性树脂封片。高倍镜下观察，对免疫组织化学法染色结果进行评分[9]，不着色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，深褐色为3分，评分≥2分判定为阳性。

2 结 果

2.1胃癌组织和癌旁组织中circMRPS35和KAT7 mRNA表达水平比较 胃癌组织和癌旁组织中circMRPS35表达水平分别为0.813±0.150、1.913±0.361，KAT7 mRNA表达水平分别为3.026±0.382、1.021±0.263。与癌旁组织相比，胃癌组织中circMRPS35表达水平明显降低(t=110.884，P<0.001)，KAT7 mRNA表达水平明显升高(t=110.884，P<0.001)。

2.2胃癌组织中circMRPS35和KAT7 mRNA表达水平的相关性 Pearson相关分析结果显示，胃癌组织中circMRPS35表达水平与KAT7 mRNA表达水平呈负相关(r=-0.504，P<0.001)。

2.3胃癌组织和癌旁组织中KAT7蛋白表达情况比较 KAT7蛋白染色呈棕黄色位于细胞核，见图1。胃癌组织中KAT7蛋白阳性率为70.5%(62/88)，明显高于癌旁组织的13.6%(12/88)，差异有统计学意义(χ2=58.294，P<0.001)。

2.4胃癌组织中circMRPS35和KAT7 mRNA表达水平与临床病理参数的关系 不同TNM分期患者胃癌组织中circMRPS35、KAT7 mRNA表达水平差异有统计学意义(P<0.05)。不同性别、年龄、肿瘤最大径、肿瘤位置、分化程度及淋巴结转移情况患者胃癌组织中circMRPS35、KAT7 mRNA表达水平差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

2.5胃癌组织中circMRPS35、KAT7 mRNA表达水平对患者生存预后的影响 所有患者随访时间为2～36个月，平均(26.6±3.5)个月，死亡27例，失访2例，3年总体生存率为68.6%(59/86)。分别以circMRPS35、KAT7 mRNA表达水平均值0.813、3.026为界，分为circMRPS35高表达组(n=42)和低表达组(n=44)，KAT7 mRNA高表达组(n=43)和低表达组(n=43)。circMRPS35低表达组患者3年总体生存率为50.0%(22/44)，明显低于高表达组患者的88.1%(37/42)，差异有统计学意义(χ2=7.163，P<0.001)。KAT7 mRNA高表达组患者3年总体生存率为48.8%(21/43)，明显低于低表达组患者的88.4%(38/43)，差异有统计学意义(χ2=7.321，P<0.001)，见图2。

图1 胃癌组织与癌旁组织中KAT7蛋白表达情况(×200)

表2 胃癌组织中circMRPS35、KAT7 mRNA表达水平与临床病理参数的关系

续表2 胃癌组织中circMRPS35、KAT7 mRNA表达水平与临床病理参数的关系

注：A为circMRPS35高、低表达患者的Kaplan-Meier生存曲线；B为KAT7 mRNA高、低表达患者的Kaplan-Meier生存曲线。图2 胃癌组织中circMRPS35、KAT7 mRNA高、低表达患者的Kaplan-Meier生存曲线

2.6单因素及多因素Cox回归分析影响胃癌患者预后的危险因素 以胃癌患者的生存情况作为因变量(1=死亡，0=存活)，纳入性别(1=女，0=男)、年龄(1=≥60岁，0<60岁)、肿瘤位置(1=幽门/胃窦部，0=胃底/胃体部)、肿瘤最大径(1=>5 cm，0=≤5 cm)、分化程度(1=低分化，0=高/中分化)、TNM分期(1=Ⅲ期，0=Ⅰ～Ⅱ期)、淋巴结转移情况(1=有淋巴结转移，0=无淋巴结转移)、circMRPS35(1=低表达，0=高表达)、KAT7 mRNA(1=高表达，0=低表达)为自变量进行单因素COX回归分析，将差异有统计学意义的指标又纳入多因素Cox回归分析模型，结果显示，胃癌组织中circMRPS35低表达、KAT7 mRNA高表达、TNM分期为Ⅲ期是胃癌患者预后的独立危险因素(P<0.05)，见表3、4。

表3 影响胃癌患者预后的单因素Cox回归分析结果

表4 影响胃癌患者预后的多因素Cox回归分析结果

3 讨 论

2020年我国胃癌新发病例数为34.6万，发病率达24.3/10万，且发病率有逐渐增高的趋势[10]。近年来，随着对胃癌发病机制研究的不断深入，新开发的治疗药物，如免疫检查点抑制剂及分子靶向药物等，改善了患者的远期生存状况[11]。但治疗过程中仍然存在治疗不敏感或治疗一段时间后出现治疗抵抗的现象。因此，寻找与胃癌发生、发展有关的新机制，对于敏感治疗药物的研发、实现胃癌的个体化治疗等意义重大。

circRNA是具有共价闭环结构的新型RNA分子，主要位于细胞质中，少部分位于细胞核中。近年来研究发现，circRNA可以充当微小RNA的分子海绵或内源性竞争RNA，进而调控靶基因的表达；也可与RNA结合蛋白结合，从而调节特定蛋白的表达；其还具有参与蛋白翻译等功能，从而间接参与一些疾病的发生、发展过程[12]。circMRPS35是近年来新发现的具有肿瘤调控功能的RNA分子。研究发现，circMRPS35能够通过抑制抑癌基因PTEN的表达，促进肝癌的进展[6]。本研究发现，胃癌组织中circMRPS35表达水平较癌旁组织明显降低(P<0.05)。既往研究利用二代测序对胃癌组织及癌旁组织中差异性表达的circRNA进行筛选，结果也表明胃癌组织中circMRPS35表达下调[7]，与本研究利用实时荧光定量PCR检测结果一致。目前，胃癌组织中circMRPS35表达下调的机制尚不清楚，可能与胃癌组织中N6-甲基腺苷(m6A)对circMRPS35修饰后促进其降解有关。研究表明，胃癌组织中m6A修饰参与circRNA的转录和降解调控，circMRPS35被m6A修饰后，核糖核酸内切酶能够特异性识别并降解circMRPS35，导致circMRPS35表达水平显著降低[13]。此外，本研究中TNM分期为Ⅲ期患者的胃癌组织中circMRPS35表达水平较Ⅰ～Ⅱ期患者低，表明胃癌组织中circMRPS35的低表达可能参与促进胃癌的进展。研究发现，p21、p27作为细胞周期激酶抑制因子，抑制细胞周期G1期/S期转换，而circMRPS35通过促进肿瘤细胞中抑癌基因p21、p27的表达发挥抑制肿瘤细胞增殖的作用，并通过促进E-钙黏蛋白的表达抑制肿瘤细胞上皮间质转化，抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭能力[7]。进一步分析发现，circMRPS35低表达的胃癌患者3年总体生存率更低，并且circMRPS35低表达是胃癌患者预后的独立危险因素(P<0.05)，提示检测胃癌组织中circMRPS35的表达水平有助于判断胃癌患者临床预后，circMRPS35可作为新的预后判断标志物。

KAT7是 MYST乙酰转移酶家族成员，该家族成员还包括MOZ、Ybf1/Sas3、Sas2和Tip60，参与组蛋白H4和 H3K14的乙酰化修饰。研究表明，KAT7在人类肝细胞癌[14]、膀胱癌[15]及卵巢癌[16]等多种恶性肿瘤中异常表达率增加，并通过激活Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)信号通路促进肿瘤的恶性增殖和转移。本研究表明，胃癌组织中KAT7 mRNA表达水平和蛋白阳性率均较癌旁组织升高，其原因一方面可能与参与KAT7 mRNA转录后稳定性调控的微小RNA-639表达水平降低有关，肿瘤中微小RNA-639表达水平降低导致KAT7 mRNA稳定性增加，进而促进下游Wnt/β-catenin信号通路的激活，导致肿瘤的侵袭、转移能力增强[17]；另一方面，KAT7蛋白表达的稳定性也受到泛素化的修饰调节。研究表明，胃癌发生时泛素化复合体不能泛素化降解KAT7蛋白，KAT7蛋白不能进入蛋白酶体途径进行降解，而KAT7蛋白的过度表达能够显著激活丝裂原活化的蛋白激酶信号通路，促进肿瘤细胞的增殖[18]。此外，本研究中胃癌组织KAT7 mRNA表达水平与TNM分期有关，提示KAT7表达上调促进了胃癌的进展。研究表明，KAT7磷酸化激活后能够结合细胞周期素激酶1，促进肿瘤细胞的有丝分裂，而利用RNA干扰技术抑制KAT7的表达后，可抑制肿瘤细胞的恶性增殖，进一步证实了KAT7表达上调对肿瘤增殖的促进作用[19-20]。此外，胃癌组织中KAT7 mRNA高表达是胃癌患者预后的独立危险因素(P<0.05)，表明KAT7可能有潜力作为新的胃癌预后判断标志物，针对以KAT7为靶点的治疗可能有利于改善胃癌患者的预后，值得临床深入研究。

本研究发现，胃癌组织中circMRPS35表达水平与KAT7 mRNA表达水平呈负相关(r=-0.504，P<0.001)。JIE等[8]研究表明，circMRPS35能够作为分子支架，招募并结合KAT7，诱导下游周期调控蛋白p21的表达，发挥阻滞细胞周期，抑制肿瘤恶性增殖的功能。因此，胃癌组织中circMRPS35表达水平降低导致其不能结合KAT7，细胞核中KAT7表达水平升高并激活下游信号通路，促进胃癌进展，但目前二者之间的作用机制尚不清楚，需要进一步研究。本研究通过单因素及多因素Cox回归分析发现，circMRPS35低表达、KAT7 mRNA高表达、TNM分期为Ⅲ期是胃癌患者预后的独立危险因素(P<0.05)。临床上可以通过检测胃癌组织中circMRPS35、KAT7 mRNA的表达水平对胃癌患者的预后进行评估，对不同评估结果的胃癌患者制订个体化的治疗及随访方案，以改善患者预后。

综上所述，胃癌组织中circMRPS35表达水平降低，而KAT7 mRNA表达水平及蛋白阳性率升高。circMRPS35低表达、KAT7 mRNA高表达、TNM分期为Ⅲ期是胃癌患者预后的独立危险因素。但限于本研究样本量较小，未对不同临床特征的患者群体进行分层分析，有待今后开展前瞻性的临床研究深入探索。