复合乳酸菌制剂对犊牛生长、肠道菌群与免疫性能的影响

宋利文，赵 濛，杨凯鑫，高 民，胡红莲

（1.内蒙古自治区农牧业科学院动物营养与饲料研究所，内蒙古 呼和浩特 010031；2.内蒙古农业大学动物科学学院，内蒙古 呼和浩特 010018）

随着家畜养殖的集约化进程， 自20 世纪90年代以来抗生素使用量激增， 显著提升了动物的生长性能并维持动物健康，但是，抗生素的广泛应用导致动物对抗生素的耐药性增加， 抗生素残留以及通过食物链威胁人类健康［1］。 2020 年7 月1日，我国明确规定全面禁止饲料中添加抗生素［2］，因此， 研发抗生素替代品并对其效果进行评估，是目前畜牧业关注的热点问题。 饲料添加剂具有提高牲畜免疫力、降低病患、提高采食量与加速生长等功效［3］。 乳酸菌是最常用的饲料添加剂之一，也是反刍动物胃肠道主要菌群之一［4］，可以产生大量消化酶，对于饲料中的粗纤维具有降解功能，有助于饲料营养成分的充分消化吸收［5］。乳酸菌可以促进白细胞介素、肿瘤坏死因子和干扰素等细胞因子的释放，使其参与到免疫过程［6］。 目前，关于益生菌对动物粪便菌群影响的研究多集中在单胃动物［7］。该研究拟以30 日龄犊牛为试验动物， 在犊牛饮水中添加复合乳酸菌微生态制剂， 探讨复合乳酸菌制剂对荷斯坦犊牛生长性能、生化指标及免疫指标等参数的影响，进而评估复合乳酸菌制剂在犊牛生产中的应用效果，为今后在实践中广泛推广这类抗生素替代品提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验动物与分组

选择体重相近、健康状况良好的30 日龄荷斯坦犊牛20 头，随机分为对照组和试验组，每组10头。

1.2 复合乳酸菌制剂

试验选择的复合乳酸菌制剂由云南天腾化工有限公司提供， 主要成分是干酪乳杆菌为主的复合菌种。 该复合乳酸菌制剂18 ℃左右避光保存，其活菌数≥2×108CFU/mL，在使用前需摇匀。

1.3 试验设计

对照组与试验组犊牛饲喂相同的基础日粮。 对照组正常饮水；试验组犊牛饮水中添加复合乳酸菌制剂（从犊牛进入试验基地开始为第1天，连续添加3 d，从第2 周开始每周二与周五各添加1 次），饮水与复合乳酸菌制剂调配比例为50∶1，犊牛饮水量为7～8 L/d，复合乳酸菌制剂的添加量约为150 mL/（头·d）。复合乳酸菌制剂的添加方式为一次性添加，2 h 内喝完为最佳。试验期为90 d。饲料配方由内蒙古牧泉元兴饲料有限公司提供， 饲料组成及营养水平见表1。

1.4 主要试剂与仪器

ELISA 试剂盒 （南京建成生物工程研究所）、半自动生化分析仪（A6，北京松上技术有限公司）、酶标仪（华东电子DG5033A）、采血管、离心管与尖嘴吸管。

1.5 样品采集与测定指标

1.5.1 生长性能测定

分别于试验第1 天与试验第90 天对晨饲前的犊牛进行空腹称重， 计算犊牛平均日增重（ADG），平均日增重=（试验末重-试验始重）/试验天数。

1.5.2 腹泻率测定

从试验第1 天开始每天记录对照组和试验组犊牛的腹泻天数与腹泻头数， 用于计算对照组和试验组犊牛腹泻率，腹泻率（%）=［（腹泻头数×腹泻天数）/（总头数×总天数）］×100。

1.5.3 粪样采集与指标测定

分别于试验1、30、60、90 d， 从每组随机选择5 头犊牛，采集新鲜粪样置于50 mL 离心管中，立即转入-20 ℃冰箱冻存， 用于测定粪便中细菌总数、乳酸菌和大肠杆菌数量，菌群数量以每克粪便中所含细菌群落总数x 的对数表示［lg（xCFU/g）］，其中CFU（conlony forming unit）为菌落形成单位。

表1饲料组成及营养水平（干物质基础）

细菌总数测定采用营养琼脂培养基， 乳酸菌采用MRS 琼脂培养基，大肠杆菌采用麦康凯琼脂培养基。 各取不同时间点5 g 粪便样品置于三角瓶中，加入45 mL 灭菌生理盐水并振荡混匀。吸取1 mL 样品上清液移入装有9 mL 灭菌生理盐水的试管中振荡混匀，即为10-2稀释度的样品处理液，如此进行倍比稀释。 分别吸取1 mL 10-4、10-5和10-6稀释度的样品处理液至无菌培养皿中， 每个梯度3 个重复，然后加入高压灭菌的琼脂培养基，充分混匀。 待培养基凝固后放于37 ℃恒温培养箱中培养24 h， 用Scan 300 型全自动菌落计数器进行菌落计数。

1.5.4 血液样品采集与指标测定

从每组随机筛选出8 头犊牛，分别于试验1、30、60、90 d 采集晨饲前颈静脉血液10 mL， 用于血液生化、抗氧化与免疫指标测定，每次采集时间与顺序相同。倾斜放置析出血清后，3 000 r/min离心10 min， 用尖嘴吸管取上层血清， 分装于1.5 mL 离心管中，立刻转入-20 ℃冰箱冻存。 采用半自动生化分析仪测定葡萄糖 （GLU）、 尿素氮（BUN）、总 蛋 白（TP）、白 蛋 白（ALB）、甘 油 三 酯（TG）、肌 酐（CRE）含 量 与 碱 性 磷 酸 酶（ALP）活性；血清抗氧化指标：总抗氧化能力（T-AOC）、丙二醛（MDA）含量，过氧化氢酶（CAT）与超氧化物歧化酶（SOD）活性；血清免疫指标：IgA、IgG、IgM含量。

1.6 数据统计

试验数据通过Excel 2010 初步整理， 采用SPSS 20.0 统计学软件进行独立样本t 检验。 试验结果表示为“平均值±标准差”，P<0.05 表示差异显著，P<0.01 表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 添加复合乳酸菌制剂对犊牛生长性能的影响

对照组和试验组犊牛初生重、 试验始重、试验末重与平均日增重均差异不显著（P>0.05）。 试验组的平均日增重高于对照组， 增加了9.09%（见表2）。

表2 添加复合乳酸菌制剂对犊牛生长性能的影响 单位：kg

2.2 添加复合乳酸菌制剂对犊牛腹泻率的影响

试验组与对照组犊牛在试验期间均出现了不同程度的腹泻，对照组腹泻率为32.88%，试验组腹泻率为24.00%，试验组犊牛的腹泻率低于对照组。

2.3 添加复合乳酸菌制剂对粪便菌群数量的影响

由表3 可知，随着日龄的增加，对照组犊牛大肠杆菌数随日龄的增加呈先下降后上升趋势，试验组犊牛大肠杆菌数呈下降趋势。 对照组大肠杆菌数在试验期均显著（P<0.05）高于试验组。 随着日龄的增加，犊牛乳酸菌数呈上升趋势，试验组犊牛乳酸菌数在试验1、60、90 d 时显著 （P<0.05）高于对照组。 随着日龄的增加，犊牛细菌总数呈上升趋势， 对照组与试验组差异均不显著（P>0.05）。

表3 添加复合乳酸菌对犊牛粪便菌群数量的影响

2.4 复合乳酸菌制剂对犊牛血清生化指标的影响

由表4 可知， 试验组和对照组犊牛血清中GLU 含量在试验期间呈先上升后下降趋势，30 d 达到最高值，90 d 达到最低值， 且30、90 d时试验组显著（P<0.05）高于对照组。 试验组血清中BUN 含量在试验第1 天显著 （P<0.05）高于对照组。 试验90 d 内， 试验组和对照组犊牛血清中TP 含量均存在上升趋势， 且对照组在60、90 d 显著（P<0.05）高于试验组。 2 组犊牛血清中ALB 与TG 含量在试验各个时期均无显著（P>0.05）差异。 犊牛血清中CRE 含量在试验第1 天最高，且试验组显著（P<0.05）高于对照组，在30 d 时对照组显著（P<0.05）高于试验组。 2组ALP 活性随着日龄的增加均呈先上升后下降的趋势。

表4 添加复合乳酸菌对犊牛血清生化指标的影响

2.5 复合乳酸菌制剂对犊牛血清抗氧化指标的影响

由表5 可知，2 组犊牛血清中抗氧化指标均无显著（P>0.05）差异，其中T-AOC 含量在试验期内呈下降趋势。CAT 活性呈先上升后下降趋势，在60 d 时达到最高值， 在90 d 时达到最低值。 SOD活性呈先上升后下降趋势。 MDA 含量呈先下降后上升趋势，在试验第1 天为最高值，在60 d 时达到最低值。

表5 复合乳酸菌制剂对犊牛血清抗氧化指标的影响

2.6 复合乳酸菌制剂对犊牛血清免疫指标的影响

由表6 可知， 日粮中添加复合乳酸菌制剂对血清免疫指标无显著（P>0.05）影响。 随着日龄的增加， 试验组与对照组的IgA、IgG 含量呈上升趋势，在90 d 时达到最高值，且高于对照组；对照组IgM 含量呈上升趋势，但试验组呈下降趋势，且在90 d 时，对照组的IgM 含量显著（P<0.05）高于试验组。

表6 复合乳酸菌制剂对犊牛血清中IgA、IgG、IgM 含量的影响

3 讨论

3.1 添加复合乳酸菌制剂对犊牛生长性能与腹泻率的影响

犊牛饲喂乳酸菌制剂可提高饲料的消化和利用效率，以及提高犊牛干物质采食量［8］。 Zhao 等［9］通过从犊牛初生到断奶饲喂益生菌发现， 益生菌可显著增加犊牛的体重。 吕利军等［10］将益生菌添加于犊牛饲料， 发现育肥前期日增重提高了14.9%，说明益生菌可能通过改变胃肠道的微生物区系，使胃肠道消化机能和吸收能力提升，也可能是其自身的产酶与产酸能力， 使犊牛瘤胃中的消化酶得到补充，进而产生积极影响。该研究结果发现，饲喂复合乳酸菌对犊牛的日增重无显著影响，但是有增加趋势。

犊牛代乳粉中添加乳酸菌同样发现， 不仅瘤胃、网胃早期发育明显，采食量以及犊牛生长性能有所增加，而且降低了腹泻率［11-12］，乳酸菌可以维持后备牛肠道微生物平衡［13］，并防止腹泻［14］。有研究显示，酵母培养物能促进动物肠道有益菌群的增殖，并降低致病菌，从而减少动物腹泻的发生［15］。该研究与前人研究结果相似， 犊牛饮水中添加乳酸菌制剂可以降低犊牛腹泻率。

3.2 添加乳酸菌制剂对犊牛粪便菌群数量的影响

稳定的肠道菌群是犊牛健康的重要保障，因此， 构建犊牛肠道菌群环境对于提高其免疫能力极其重要。 犊牛的健康状况与其肠道中微生物所构成的微生态平衡存在一定的相关性。当肠道菌群发生紊乱时， 正常菌群会伴随着出现异常情况，或者发生定植部位的转换等，造成不同程度的胃肠道机能损害，引起犊牛腹泻率、发病率和死亡率的提高。 应用复合益生菌调节肠道微生物菌群是一种重要手段， 可以有效改善肠道健康、促进消化、减少腹泻［16］。 断奶仔猪日粮中添加复合益生菌制剂可以显著降低粪便中的大肠杆菌含量［17］，对仔猪生产性能有良好促进功能。 使用复合益生菌制剂饲喂梅花鹿能够显著降低粪便大肠杆菌， 显著增加乳酸杆菌数， 使梅花鹿的生长性能与肠道微生物区系得到 显 著 提 升 与 优 化［18］。 Collington 等［19］研 究 发现，乳酸杆菌具有较强的益生效果，可提高动物生长性能， 并且可保持微生物菌群平衡以及提高机体免疫力。 陈鲜鑫等［20］就生长猪饲喂乳酸菌进行研究发现，猪粪中乳酸菌含量显著提升。李清定等［21］也进行了类似的试验，结果显示饲喂生长猪微生物发酵饲料可提高粪样中乳酸菌数量，抑制大肠杆菌数量。 该研究发现在犊牛饮水中添加乳酸菌制剂在试验结束时可抑制大肠杆菌数并有效提高粪样乳酸菌的数量。 该试验通过粪便采样结果显示， 饲喂复合乳酸菌使大肠杆菌数显著降低， 且粪便中的乳酸菌数量显著升高， 这些结果说明该试验使用的复合乳酸菌对犊牛胃肠道的菌群有改善功效。

3.3 添加乳酸菌制剂对犊牛血清生化指标、抗氧化指标与免疫指标的影响

血清总蛋白指标可以说明蛋白质的利用率， 大量研究表明饲喂乳酸菌制剂可以帮助动物肝脏合成蛋白质，增强机体免疫力。肖海霞等［22］研究发现， 血清白蛋白含量增加可帮助增强有机体的代谢水平和免疫力， 增强肝脏合成蛋白质的能力。 该试验结果表明，添加复合乳酸菌后血清中的总蛋白与白蛋白含量差异不显著，但有减少趋势。 犊牛血清中尿素氮指标降低，则代表着蛋白质沉淀增加或分解速度的下降［23］。 血清中尿素氮含量可以反映机体生长性能以及体内蛋白质合成等， 尿素氮的减少标志着氨基酸状况良好且动物的蛋白质合成正常。 该试验结果表明， 添加复合乳酸菌后虽然犊牛血清中尿素氮的含量处在正常参考值范围内， 但有增加趋势。 血糖浓度在有机体的组织器官中发挥着重要作用， 是生物体内新陈代谢不可缺少的营养物质，是反映有机体能量的重要标记，同时，血糖的变化反映了机体所处的生理状态。 杨海英等［24］报道，犊牛饲喂乳酸菌制剂对血清指标葡萄糖含量无显著性影响。 动物血糖浓度不应超过6.1 mmol/L，该试验葡萄糖在正常范围内，与前人结果一致。 碱性磷酸酶主要由造骨细胞产生［25］，其活性与动物生长速度和生长性能有关，在应激条件下，血清碱性磷酸酶的含量也会增加，表明犊牛饲喂复合乳酸菌制剂能增强犊 牛 的 抗 应 激 能 力［26］。 伍 革 民 等［27］研 究 发 现，增加血液中碱性磷酸酶的活性， 对动物的生长速度、日增重，细胞新陈代谢等有增强作用。 殷溪沙等［28］研究发现，血清中碱性磷酸酶的含量随着乳酸菌素含量的增加而升高。

该研究发现添加复合乳酸菌制剂的犊牛血清中尿素氮、总蛋白、甘油三酯、肌酐均在正常的参考范围内，但是白蛋白有升高的趋势，表明乳酸菌制剂对犊牛体内肝脏的蛋白质合成代谢能力与肾脏功能以及脂类代谢有积极影响。 血液中碱性磷酸酶的活性显著增多， 表明饲喂乳酸菌制剂有利于加强犊牛的非特异性免疫功能及提高动物的生长性能。 血液中的总抗氧化能力为动物抗氧化状态是否良好的依据， 超氧化物歧化酶是动物机体重要的抗氧化酶，是机体的主要抗氧化酶，其活性代表了机体的抗氧化性能， 是生物防御体系的关键酶之一。 抗氧化剂可作为饲料添加剂在动物生产过程应用，并且可以提高动物的生长性能，部分乳酸菌可以产生少量过氧化氢， 过氧化氢可以抑制很多病原菌的生长，也可以形成酸性环境，从而起到杀菌的作用。该研究试验期结束时，饲喂复合乳酸菌的犊牛的总抗氧化能力和丙二醇的活性增高，超氧化物歧化酶和过氧化氢酶的含量减少，表明复合乳酸菌制剂可在一定程度上提高犊牛的抗氧化能力。

IgG 是血清中含量最高、 维持时间长的一种免疫球蛋白，参与组织间隙及体表的防御，具有中和毒素、沉淀抗原及激活补体等功能，尤其在体液免疫中发挥着重要的作用。 IgA 包括血清型和分泌型，血清中含量虽然相对不多，但也具有抗菌、抗病毒和抗毒素等免疫活性［29］。外周血液含有大量具有结合抗原、激活补体和调节作用的免疫球蛋白IgG、IgA 和IgM 等。 免疫球蛋白含量直接反映出机体对病原的免疫抗性［30］。 董佳琦等［31］就哺乳母猪添加微生态制剂进行了研究，试验结果表明免疫球蛋白IgG 含量升高［32］。 反刍动物添加复合益生菌可以加强血液中的抗体水平，对动物的体液免疫有提高作用［33］。 该试验研究发现， 在犊牛饮水中添加复合乳酸菌制剂对免疫指标IgG 影响最大，在试验结束时试验组IgG、IgA 含量高于对照组， 反映出犊牛的免疫能力有所提升。

4 结论

在饮水中添加复合乳酸菌制剂可以降低荷斯坦犊牛的腹泻率， 减少粪便中大肠杆菌数量，增加乳酸菌数量，对犊牛胃肠道的菌群有改善功效，提高血清中葡萄糖、尿素氮、肌酐、碱性磷酸酶及免疫球蛋白的含量，对犊牛的健康免疫有积极影响。