9 株绵羊肺炎支原体内蒙古分离株P113 基因克隆及蛋白序列分析

戴伶俐，王 娜，白 帆，张 帆，宋 越，张月梅，达来宝力格，李晓艳，王根云，赵世华

（1. 内蒙古自治区农牧业科学院， 内蒙古 呼和浩特 010031；2. 呼和浩特市动物疫病防控中心， 内蒙古 呼和浩特010020）

绵羊肺炎支原体（Mycoplasma ovipneumoniae，MO）是重要的羊呼吸道病原体，能引起绵羊和山羊非典型性肺炎。 患病羊只出现不同程度的临床症状，主要表现为咳嗽、流鼻涕、渐进性消瘦、腹泻和渗出性间质性肺炎［1］，给养羊产业造成巨大的经济损失。MO 在我国广泛存在，主要集中在肉羊、奶羊主产区，如内蒙古、新疆、甘肃、四川等地［2］。羊只一旦感染MO，即便未出现明显的临床症状和肺部病变， 也会严重影响生产性能， 如日增重下降、胴体质量降低等［3］。 应用抗生素治疗并不能降低MO 在羊体内的定植率［4］，通过抗生素治疗无法达到有效的治疗效果， 患病羊只常常出现反复发病的情况。 非典型性肺炎是影响养羊业健康发展的重要呼吸道疫病［5-6］，因此，急需开发高效的诊断方法和疫苗产品，用于该病的有效防控。目前对于MO 的重要功能蛋白研究较少， 严重影响了其分子致病机制的研究以及防控技术的开发。

肺炎支原体入侵宿主造成感染的第1 步是黏附，因此，确定支原体黏附因子是防治感染的有效途径。 P97 蛋白是猪肺炎支原体的黏附因子，介导猪肺炎支原体与呼吸道纤毛黏附［7］，是重要的毒力因子［8］。 根据生物信息学分析结果推测MO 的P113 蛋白与猪肺炎支原体黏附蛋白P97 直系同源，可能与MO 的黏附相关［9］。P113 蛋白C 末端具有良好的免疫原性［10］，且含有与P97 蛋白类似的重复序列。 杨发龙等［11］对MO 的P113 蛋白C末端重复区域进行原核表达， 证明该区域具有良好的免疫原性。 根据序列及结构分析推测，P113 蛋白可能是MO 的黏附因子， 是潜在的毒力因子，因此，对该蛋白进行深入分析有利于进一步验证其生物学功能。 该研究对9 株MO 内蒙古分离株P113 基因序列进行扩增测序，分析P113 蛋白C 末端序列重复区域在不同菌株之间的变化情况， 为研究MO 黏附因子分子机制提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 MO 菌株

MO 内蒙古分离株9 株，由内蒙古自治区农牧业科学院兽医研究所分离、 鉴定， 菌株信息见表1。MO 标准株Y98，由内蒙古自治区农牧业科学院兽医研究所保存。

表1 MO 内蒙古分离株信息

1.1.2 主要试剂

支原体培养基， 青岛海博生物技术有限公司产品；马血清，北京索莱宝科技有限公司产品；细菌基因组DNA 提取试剂盒，天根生化科技（北京）有限公司产品；2×高保真PCR Mix 预混液、氨苄西林、琼脂糖、PCR 产物胶回收试剂盒，购自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.1.3 主要仪器设备

恒温摇床（THZ-98AB，上海一恒科学仪器有限公司），PCR 仪（Verit，ABI 公司），凝胶成像系统（Universal HoodⅡ，Bio-Rad 公司）， 电泳仪（DYCP-31DN，北京六一生物科技有限公司），生物安全柜（AirstreamRA2，Esco 公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 MO 培养及基因组DNA 提取

按照支原体培养基说明书配制培养基， 按照1∶10 比例接种MO 菌液， 在37 ℃、150 r/min 恒温摇床培养箱中连续培养至培养基颜色变为橙黄色；收集培养产物，4 ℃、13 000 r/min 离心20 min，弃尽上清液， 菌体沉淀用于提取基因组DNA，操作过程按照细菌基因组DNA 提取试剂盒说明书。获得的各菌株基因组DNA 保存于-20 ℃，备用。

1.2.2 P113 基因克隆与测序

根据GenBank 公布的支原体GZ-QX1 株P113 基因序列 （GenBank 登录号：KR270152.1），使用Oligo 7.37 软件设计P113 基因片段扩增引物，上游引物P113-F：5′-CGCGGATCCGCGGCAAA ACAAGATTACTAT-3′；下游引物P113-R：5′-CCGG AATTCCGGTTATTCAAACTCTTTTAG-3′。

以各MO 菌株基因组DNA 为模板， 扩增P113 基因片段。 PCR 反应体系：2×高保真PCR Mix 预 混 液25 μL，P113-F （10 μmol/L）1 μL，P113-R（10 μmol/L）1 μL，基因组DNA 模板1 μL，用无菌无酶水补至50 μL。 PCR 扩增条件为：95℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸80 s，30 个循环；72 ℃最终延伸10 min；4 ℃保温。 PCR 阳性对照模板为MO Y98 株基因组DNA，阴性对照模板为超纯水。PCR 产物经过1%琼脂糖凝胶电泳， 切下目的片段凝胶块，用PCR 产物胶回收试剂盒回收目的片段， 纯化PCR 产物送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

1.2.3 P113 蛋白序列分析

测序获得的各菌株P113 基因序列用NCBI 在线BLSAT 软件进行初步序列比对。 从NCBI 下 载3 株MO 菌 株ATCC 29419 （Gen-Bank 登录号：KR021380.1）、GZ-QX1（GenBank登 录 号：KR270152.1）、NCTC 10151 （GenBank登录号：LR215028.1）的P113 基因DNA 序列，采用DNASTAR 和MEGA 7.0 软件将各菌株P113 基因序列翻译为氨基酸序列并分析其进化关系。

2 结果与分析

2.1 P113 基因片段扩增结果

以不同MO 分离株基因组DNA 为模板扩增P113 基因片段， 各菌株扩增产物大小不完全一致，片段长度介于1 100～1 300 bp（见图1），提示P113 基因具有一定的多样性。

图1 MO 不同分离株P113 基因片段PCR 扩增结果

2.2 P113 蛋白序列比对结果

将测序获得的不同菌株P113 基因片段序列翻译为氨基酸序列进行比对，与NCBI 下载的3 株MO 菌 株ATCC 29419、GZ-QX1、NCTC 10151 的P113 蛋白序列相比，9 株MO 内蒙古分离株P113蛋白序列存在缺失或者插入。 缺失或者插入的序列存在一定的规律，P113 蛋白序列内部存在重复序列，以KKAEGA（S）QNQG 为主要重复序列单元（见图2）。

图2 截短P113 蛋白序列比对结果

不同菌株包含的KKAEGA （S）QNQG 重复序列单元数量不完全相同。 从NCBI 下载的3 株MO菌株P113 蛋白序列中， 该重复序列单元含有10个；MO 内蒙古分离株NM01-MO、CK-MO、NM03-MO、DMQ-ZM-MO 所含重复序列单元数量均高于10 个， 其余分离株所含重复序列单元数量较少，出现序列缺失（见表2）。

表2 MO 内蒙古分离株及参考菌株P113蛋白C 末端氨基酸重复序列单元数量 单位：个

2.3 P113 蛋白序列进化树分析

MO 不同分离株P113 蛋白序列进化树分析结果表明，ATCC 29419、GZ-QX1 和NCTC 10151的遗传距离最近，内蒙古分离株DMQ-ZM-MO 和LK-MO 与前述3 株菌的遗传距离最近，同属一个分支；D00188-MO、SZW03-MO 和DMQ-BT-MO与其他菌株遗传距离较远（见图3）。

图3 截短P113 蛋白序列遗传进化树

3 讨论

黏附蛋白是支原体侵害宿主机体的关键毒力因子之一［12］。 目前已有MO 分子致病机制相关研究［13-16］，但通过探究MO 关键蛋白功能来解析其分子致病机制方面的研究还十分有限。

由于MO 的P113 蛋白与猪支原体黏附因子P97 蛋白存在较高的同源性， 且C 末端都具有重复序列，因此，推测P113 蛋白是MO 潜在的黏附因子，但是目前缺少其直接影响MO 黏附作用的证据。已有研究证明MO 的P113 蛋白具有良好的免疫原性，具有开发为亚单位疫苗的潜力［10，17］。 由于P113部分基因序列较为保守，属于MO 特异性序列，研究者们已经据此研发相应的检测方法，例如：制备P113 蛋白单克隆抗体，用于MO 间接免疫荧光检测和血清抗体检测［18］；建立基于P113 基因的常规PCR 检测方法和荧光定量PCR 检测方法［19-20］。

该研究通过对2017—2022 年在内蒙古地区分离的MO 菌株P113 基因片段克隆测序，发现不同菌株P113 基因片段长度存在一定差异，这种差异主要是由于C 末端重复区域的长度不一致而引起。 该研究发现，MO 内蒙古分离株P113 蛋白C末端重复序列单元为KKAEGA（S）QNQG，不同分离株的重复数量并不完全相同，但是这种差异与MO分离株分离的时间和地点没有明显的相关性，可能与菌株自身的生物学特性相关。由于P113 蛋白是潜在的毒力因子，因此，重复序列单元的数量可能与MO 的毒力强弱有关，这有待于进一步研究。

4 结论

成功扩增9 株MO 内蒙古分离株的P113 基因片段，这些菌株的P113 蛋白C 末端重复序列单元数量存在一定差异，该结果可为后续研究MO P113蛋白生物学功能以及MO 致病机制提供参考。