新疆部分地区规模化猪场猪囊等孢球虫的套式PCR 检测及感染情况分析

彭 霞，赵乾明，王凌云，信璐瑶，赵爱云，余复昌，齐 萌

（塔里木大学动物科学与技术学院/新疆生产建设兵团塔里木动物疫病诊断与防控工程实验室，新疆 阿拉尔 843300）

猪囊等孢球虫（Cystoisospora suis）是一种常见的寄生于猪肠道的原虫，主要引起猪只消瘦、腹泻等临床症状［1］。 通常猪囊等孢球虫对成年猪无明显致病性，但可导致仔猪腹泻甚至死亡，给养猪业造成一定的经济损失［2-3］。 De Araújo 等［4］报道巴西养殖场猪囊等孢球虫感染率为3.74%（7/187）；Pettersson 等［5］报道瑞典养殖场猪囊等孢球虫感染率为5.20%（84/1 615）；Johnson 等［6］报道澳大利亚养殖场猪囊等孢球虫感染率为10.38%（30/289）；Gong 等［7］报道我国22 个省养殖场猪囊等孢球虫感染率为8.96%（1 834/20 470）；刘文婷等［8］报道我国华北地区养殖场猪囊等孢球虫感染率为34.43%（313/909）。

对于猪囊等孢球虫， 传统的检查方法主要是普通光学显微镜观察法。 随着分子生物学技术的发展，PCR 法因具有较高的敏感性和准确性，目前已广泛应用于猪囊等孢球虫的检测［9-10］。 盛祖勋等［11］采用显微镜观察法与PCR 法检测安徽省7个规模化养殖场猪粪便样本， 发现猪囊等孢球虫的感染率分别为4.20%（21/500） 和13.20%（66/500）；Joachim 等［12］采 用 显 微 镜 观 察 法 与PCR 法检测猪粪便样本， 发现猪囊等孢球虫的感染率分别为52.27%（23/44）和70.45%（31/44），结果均提示PCR 法具有较高的特异性和敏感性。 该研究以SSU rDNA 基因为靶序列， 采用套式PCR 法对采集自新疆部分地区规模化养殖场的猪新鲜粪便DNA 样本进行检测，对不同养殖场、不同年龄段猪的猪囊等孢球虫感染率进行比较， 并对获得的SSU rDNA 基因片段进行序列比对分析，以期为该地区猪囊等孢球虫病的防治提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 粪便样本

分别于新疆维吾尔自治区巴楚县、阿拉尔市、莎车县、拜城县、沙雅县、昌吉回族自治州和若羌县的7 个规模化养殖场收集801 份猪新鲜粪便样本，其中，未断奶仔猪（<20 d）、断奶仔猪（21～70 d）、育肥猪（71～180 d）和成年母猪（>180 d）的粪便样本分别为169、225、173、234 份。 每份粪便样本采用一次性无菌手套经直肠采集5～30 g，放置于干净的采样袋内，编号并记录相关信息，放入有冰袋的泡沫箱送至实验室， 置于4 ℃冷藏箱保存，待检。

1.1.2 主要试剂

E.Z.N.A.RD4015-02 粪便全基因组DNA 提取试剂盒，OMEGA Bio-Tek 公司产品；2×EasyTaq PCR SuperMix（+dye），北京全式金生物技术有限公司产品；DNA Marker DL 2 000，宝日医生物技术（北京）有限公司产品。

1.1.3 主要仪器设备

PCR 仪为美国Bio-Rad 公司产品； 琼脂糖凝胶电泳仪为北京六一生物科技有限公司产品；凝胶成像系统为美国ProteinSimple 公司产品； 微量移液器为德国Eppendorf 公司产品；台式高速离心机为湖南赫西仪器装备有限公司产品。

1.2 试验方法

1.2.1 粪便样本DNA 提取

每份粪便样本挑取200 μg 左右， 按照E.Z.N.A.RD4015-02 粪便全基因组DNA 提取试剂盒操作流程，收集DNA 提取液并标记，-20 ℃保存。

1.2.2 猪囊等孢球虫的套式PCR 检测

基于猪囊等孢球虫SSU rDNA 基因位点，参照盛祖勋等［11］报道的文献设计引物，由苏州金维智生物科技有限公司合成。 引物信息见表1。

表1 套式PCR 引物信息

套式PCR 扩增反应体系为25 μL：2×EasyTaq PCR SuperMix （+dye）12.5 μL， 上、 下游引物（20 μmol/L） 各0.3 μL，DNA 模 板1 μL，ddH2O 10.9 μL。 第1 轮PCR 反应以猪粪便基因组DNA 为模板， 第2 轮PCR 反应以第1 轮PCR 产物为模板。第1 轮PCR 反应条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35 个循环；72 ℃再延伸10 min。 第2 轮PCR 反应条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性45 s，52 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，35 个循环；72 ℃再延伸10 min。 每轮套式PCR 扩增均设置阳性对照和阴性对照，阳性对照为塔里木大学兽医寄生虫学实验室鉴定保存的猪囊等孢球虫DNA 样本，阴性对照为灭菌双蒸水。 扩增结束后， 取5 μL 第2 轮PCR 产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，在凝胶成像系统内观察并拍照保存。

1.2.3 序列分析及种系发育进化树构建

将所有扩增成功的PCR 阳性产物送至苏州金唯智生物科技有限公司进行双向测序。在NCBI数据库中对所获序列进行BLAST 搜索，下载相似参考序列，用Clustal X 2.1 软件对所获序列进行比对分析，根据比对结果鉴定种属。 采用MEGA 7.0软件选择邻接法（Neighbor-Joining，NJ）构建种系发育进化树，其可靠性用Bootstrap 分析检测，进行1 000 个重复。

1.2.4 统计学分析

计算猪囊等孢球虫感染率的优势比 （OR）和95%置信区间（95%CI）；采用χ2检验比较不同采样猪场以及不同年龄段猪的感染率差异，P<0.05表示差异显著，P<0.01 表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 不同养殖场猪囊等孢球虫感染情况

采用套式PCR 法对7 个规模化猪场801 份粪便DNA 样本进行检测， 发现46 份呈猪囊等孢球虫阳性，感染率为5.74%（46/801）（见表2）。7 个养殖场的粪便样本中均检测到猪囊等孢球虫，以沙雅县猪场感染率最高，为14.00%（14/100）；巴楚县、拜城县、莎车县、若羌县、昌吉回族自治州和阿拉尔市猪场的感染率分别为10.20%（10/98）、8.08%（8/99）、4.62%（6/130）、3.36%（5/149）、1.54%（2/130）和1.05%（1/95）。 不同养殖场之间猪囊等孢球虫感染率统计学差异极显著 （χ2=27.081，df=6，P<0.01）。

表2 不同养殖场猪囊等孢球虫感染情况

2.2 不同年龄段猪的猪囊等孢球虫感染情况

由表3 可知， 未断奶仔猪的猪囊等孢球虫感染率最高，为14.79%（25/169）；断奶仔猪、育肥猪和母猪的猪囊等孢球虫感染率分别为5.78%（13/225）、2.31%（4/173）和1.71%（4/234）。 不同年龄段猪的猪囊等孢球虫感染率随着年龄增长呈下降趋势，统计学差异极显著（χ2=36.366，df=3，P<0.01）。

表3 不同年龄段猪的猪囊等孢球虫感染情况

2.3 猪囊等孢球虫SSU rDNA序列比对和种系发育分析

46 份猪囊等孢球虫SSU rDNA 序列阳性套式PCR 产物送测序公司进行双向测序， 均成功获得序列。 序列比对结果显示，46 条猪囊等孢球虫SSU rDNA 序列与安徽省凤阳县猪源猪囊等孢球虫分离株（GenBank 登录号：KX808495）SSU rDNA序列的同源性均为100%， 鉴定为猪囊等孢球虫。该研究获得的猪囊等孢球虫SSU rDNA 序列与日本人源贝氏囊等孢球虫 （Cystoisospora belli）的SSU rDNA 序列（GenBank 登录号：AB268326）同源性为99.8%， 第446 核苷酸位置处存在1 个碱基替换C→T。 基于囊等孢球虫SSU rDNA 序列构建的种系发育进化树显示， 该研究中的猪源猪囊等孢球虫与加拿大猪源猪囊等孢球虫形成1 个亚群，与人源贝氏囊等孢球虫、犬源俄亥俄囊等孢球虫（Cystoisospora ohioensis）形成1 个大分支；与犬囊等孢球虫（Cystoisospora canis）、 猫囊等孢球虫（Cystoisospora felis）形成不同的分支（见图1）。

图1 基于囊等孢球虫SSU rDNA 序列构建的种系发育进化树

3 讨论

世界范围内，仔猪感染猪囊等孢球虫较常见，往往引起腹泻、脱水等症状［13］。 该研究发现，新疆部分地区的7 个规模化养殖场猪囊等孢球虫感染率为（5.74%，46/801），高于De Araújo 等［4］等报道的巴西51 个规模化养殖场猪囊等孢球虫感染率（3.74%，7/187）；低于Symeonidou 等［14］报道的希腊8 个规模化养殖场猪囊等孢球虫感染率 （6.00%，69/1 150）、Karamon 等［15］报 道 的 波 兰104 个 规 模化养殖场猪囊等孢球虫感染率 （27.82%，217/780）、盛祖勋等［11］报道的我国安徽省7 个规模化养殖场猪囊等孢球虫感染率（13.20%，66/500）、黄仪娟［16］报道的我国广东省6 个规模化养殖场猪囊等孢球虫感染率（26.48%，116/438）。 不同国家、地区、养殖场之间猪囊等孢球虫感染率存在差异，与地理环境、养殖规模、饲养方式、用药情况和检测方法等多种因素具有较大的相关性。

猪囊等孢球虫感染率与猪的年龄具有一定的相关性。该研究结果发现，未断奶仔猪的猪囊等孢球虫感染率最高，为14.79%（25/169），且随年龄的增长猪囊等孢球虫感染率呈下降趋势， 这与国内外的多数报道结果一致。 Schubnell 等［17］报道瑞士农场中未断奶仔猪的猪囊等孢球虫感染率为13.33%（4/30）， 高于断奶仔猪 ［10.00%（4/40）］；Symeonidou 等［14］报道希腊8 个规模化养殖场未断奶仔猪的猪囊等孢球虫感染率为19.13%（44/230），断奶仔猪为9.13%（21/230），而在育肥猪中未发现感染。 在国内，Gong 等［7］报道我国养殖场未断奶仔猪的猪囊等孢球虫感染率为15.07%（1 066/7 072），高于断奶仔猪［6.09%（200/3 286）］。上述研究结果显示， 未断奶仔猪更易感染猪囊等孢球虫。

猪囊等孢球虫的鉴定方法主要为形态学观察法和分子生物学方法， 形态学观察法对研究者的技术要求较高，检测结果易存在主观判断错误；基于猪囊等孢球虫特异性基因位点的分子生物学检测技术能准确鉴定猪囊等孢球虫， 还可进行系统进化分析［18-19］。 臧传佼［20］基于猪囊等孢 球虫SSU rDNA 基因位点， 采用PCR 法成功扩增出猪囊等孢球虫扬州株的序列， 与其他哺乳动物等孢属球虫的同源性均在98%以上；盛祖勋等［11］基于猪囊等孢球虫SSU rDNA 基因位点， 采用PCR 法检测出66 个猪囊等孢球虫阳性样本，其SSU rDNA 基因序列均一致， 与其他等孢属球虫的同源性在99%～100%。 该研究基于猪囊等孢球虫SSU rDNA基因位点，采用套式PCR 法扩增获得的猪源猪囊等孢球虫序列均与安徽省凤阳县猪源猪囊等孢球虫分离株同源性为100%，提示在SSU rDNA 基因位点，猪囊等孢球虫的序列遗传变异较小，存在稳定遗传特征。

该研究结果显示， 新疆部分地区规模化养殖场以未断奶仔猪的猪囊等孢球虫感染较为常见，在今后养殖过程中， 应采取进一步提高饲养管理水平， 注意控制圈舍环境卫生， 适度调整饲养密度，及时检测和药物治疗等措施，以降低猪囊等孢球虫病的发生率。

4 结论

该研究采用套式PCR 方法调查了新疆部分地区规模化猪场猪囊等孢球虫的感染情况， 发现该地区猪的猪囊等孢球虫感染率较低，为5.74%；7 个猪场均呈猪囊等孢球虫阳性， 以未断奶仔猪的猪囊等孢球虫感染率较高，为14.79%。 调查结果为该地区规模化猪场猪囊等孢球虫的检测和猪囊等孢球虫病的防治工作提供了基础数据。