二氧化钛纳米管在口腔种植领域的应用进展

马晓晴，黄绮雯 综述 唐亮 审校

暨南大学口腔医学院，广东 广州 510632

钛(titanium，Ti)具有良好的生物相容性和优异的力学性能，是一种应用广泛的牙科植入材料。但钛具有生物惰性，细菌容易黏附其表面并产生生物膜，增加种植术后并发症和失败率。另外，钛不支持骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)和成骨细胞的成骨且会降低成骨速度，导致骨结合不良[1]。近年来对钛种植体表面的改性已成为该领域研究的热点。目前对纯钛进行表面改性主要有物理处理、化学涂层、生物涂层和二氧化钛纳米管(titanium dioxide nanotubes，TNTs)修饰等方法。

采用阳极氧化技术制备的TNTs具有低细胞毒性、良好的生物相容性、高功能表面、光催化活性、良好的抗崩解性以及可调节免疫反应等优点[2]。TNTs修饰的钛种植体能增强成骨细胞功能，实现长期骨整合[3]，此外，TNTs是一种新型的可控药物释放系统，具有广谱抗菌活性，因此TNTs在口腔种植领域具有广阔的潜在应用前景。本文将从颌骨骨免疫微环境、种植体周围炎、药物递送等方面阐述TNTs在口腔种植领域的应用进展。

1 颌骨免疫微环境

种植体植入后，免疫系统被激活以调节宿主体内的局部微环境，具有良好骨免疫调节性能的骨再生生物材料可以通过调节成骨和破骨行为促进骨免疫平衡。此外，合适的免疫微环境能够促进骨再生[4]。BAI等[5]报道直径为15 nm的TNTs能显著激活血小板，在下调炎症相关基因的同时上调生长代谢相关基因，促进骨细胞树突的伸展，为骨再生和骨整合提供良好的骨免疫调节环境。BELTRÁN-PARTIDA等[6]认为TNTs可以促进血管内皮细胞的活性，支持更快的临床骨整合过程。TNTs能负载多种免疫调节细胞因子，调控免疫反应，从而创造良好的骨免疫微环境。

巨噬细胞是免疫反应的先天调节因子，通过将其极化为促炎症的M1型巨噬细胞或促愈合的M2型巨噬细胞，能产生过量的细胞因子[5]。种植体植入后，促炎的M1巨噬细胞被干扰素-γ(IFN-γ)等细胞因子激活，随后抗炎的M2巨噬细胞被白细胞介素-4(IL-4)等细胞因子激活，可促进植入物的愈合和长期稳定。GAO等[7]将免疫调节细胞因子IL-4负载到TNTs中，并在TNTs上进行水凝胶涂层，最后将IFN-γ添加到凝胶层，实现快速释放，该涂层可以在预期的时间内刺激巨噬细胞从M1表型向M2表型的极化，促进M1向M2巨噬细胞平滑转换，有助于种植体的稳定。HE等[8]将邻苯二酚基序修饰的甲基丙烯酸酯明胶水凝胶附着在TNTs上，然后将过氧化钙纳米粒子及IL-4负载到水凝胶中制备双重载药系统，结果表明释放过氧化氢的过氧化钙纳米粒子能快速清除金黄色葡萄球菌，且过氧化钙纳米粒子被包埋在水凝胶中后潜在的细胞毒性明显降低，此外该系统能诱导巨噬细胞的M2表型极化。LI等[9]用聚多巴胺(polydopamine，PDA)将IL-4固定在TNTs上，随后在TNTs上制备羧甲基壳聚糖水凝胶涂层并结合核心肽序列，发现该涂层不仅可以驱动巨噬细胞向抗炎的M2表型转换并产生修复性细胞因子IL-10，还能增强激活与MSCs分化相关的信号通路BMP/SMAD/RUNX2。YIN等[10]在TNTs上制备海藻酸盐/壳聚糖(chitosan，CH)多层膜，指出该涂层能诱导M1巨噬细胞激活BMP6/SMADs和Wnt10b/β-catenin通路，且诱导M2巨噬细胞激活TGF-β/SMADs通路以促进MSC的早期和中期成骨。YANG等[11]利用贻贝激发的PDA将银离子固定在TNTs上，认为PDA能控制Ag+的过量释放，降低银纳米颗粒的细胞毒性，并通过细胞反应性释放Ag+调节巨噬细胞从M1表型极化为M2表型的时间。CHEN等[12]采用电化学阳极氧化法制备载银纳米TNTs，指出控制释放超低剂量Ag+的载银TNTs通过抑制PI3K/Akt通路可减少下游效应分子GLUT1的释放，从而激活自噬效应以控制炎症。

种植体植入后，术后损伤的组织与其相互作用会产生大量的活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)，ROS通过氧化DNA、脂质和蛋白质破坏细胞并作为信号分子参与细胞生理调控，氧化还原的失衡会导致细胞功能紊乱，破坏细胞稳态[13]。此外，大量的ROS会引起巨噬细胞的聚集和炎症，长期的炎症会导致种植体无菌性松动[14]。YANG等[15]将白藜芦醇负载到TNTs上，指出该涂层能有效消除ROS，抑制NF-κB信号通路的活化，从而抑制炎症反应，维持骨稳态并促进MSCs的成骨分化。GAO等[16]在钛合金表面制备PDA和载银纳米TNTs涂层，发现该涂层能够清除ROS，增强细胞黏附和刺激细胞分化。YANG等[17]指出高糖状态下细胞产生过量的ROS会抑制细胞黏附和增殖，降低线粒体膜电位，诱导细胞凋亡。与纯钛喷砂表面相比，TNTs表面在糖尿病条件下产生的ROS较少，在体内外表现出良好的生物相容性和成骨能力。此外，TNTs表面通过产生更多超氧化物歧化酶以平衡ROS的表达，避免ROS的过量产生，最终缓解高糖状态下ROS对成骨的抑制。HUANG等[18]指出TNTs的抗氧化性由上调的叉头盒转录因子FoxO1驱动，FoxO1在MSCs中通过shRNA废除，因此TNTs能减轻巨噬细胞的氧化应激反应，增加抗炎细胞因子IL-10的分泌诱导M2表型的分化，进一步提高骨免疫力。

2 种植体周围炎

种植体周围炎是一种发生在种植体周围软硬组织的炎症性疾病，临床表现为不同程度的骨组织丧失，伴有种植体周围袋的形成、探诊出血及溢脓[19]。引起种植体周围炎的因素有：菌斑微生物、牙周炎、咬合过载、种植三维位置欠佳、角化龈不足、种植义齿设计不合理和修复部件松动等[20-21]。持续的感染最终会导致骨结合丧失和种植失败[22]。目前种植体周围炎的治疗方法分为非手术治疗和手术治疗，非手术治疗主要包括机械清创术、药物治疗、激光治疗和抗菌动力治疗等[23-24]。TNTs修饰的钛种植体，主要通过改性、负载生物活性分子或抗菌剂以促进种植体周软组织封闭、实现抗菌活性等多种功能，预防和控制种植体周感染。

2.1 促进种植体周软组织封闭 种植体穿龈部分强有力的软组织整合对种植体的长期成功至关重要，种植体冠部封闭由牙槽骨上的结缔组织和交界处上皮组成，结缔组织是种植体冠部封闭的重要部分，可限制连接上皮的根尖迁移，保障有效的骨结合[25]。然而，由于口腔细菌生物膜的不良反应，种植体的成功率可能会因为跨黏膜软组织完整性的损害而受到影响[26]。人牙龈成纤维细胞(human gingival fibroblasts，HGFs)作为种植体周围软组织的主要细胞，分泌含有丰富胶原纤维的细胞外基质，能促进牙龈创面的愈合、修复和再生[27]。XU等[28]在钛表面制备直径分别为30 nm、100 nm和200 nm的TNTs，发现直径为30 nm和100 nm的TNTs均能增强HGFs的黏附、增殖和细胞外基质相关基因的表达，其中直径100 nm的TNTs可以最大限度地激活HGFs功能，并降低牙龈假单胞菌在穿龈部的黏附，促进软组织附着，抑制细菌生物膜的黏附，保护牙槽骨。WANG等[29]采用阳极氧化和热氢化技术制备超亲水性TNTs，表明修饰后的表面可以大幅上调黏着斑激酶和磷酸化黏着斑蛋白激酶的表达，HGFs在氢化TNTs的黏附、迁移相对基因表达水平和细胞外基质合成均增强，而且其诱导了黏着斑激酶活化和整合素介导的黏附，提示阳极氧化和氢化修饰的超亲水纳米结构可以提高HGFs的生物活性并能促进结缔组织再生。

天然牙里牙龈纤维垂直插入牙骨质中，以获得良好的附着，而种植体周围的结缔组织纤维与牙根表面平行或成圆周排列，此结构不利于种植体周围的软组织封闭及力的传导。TNTs可以通过促进垂直纤维的插入以增强种植体周围的软组织附着，使种植体周上皮保持在修复体和种植体之间的垂直水平[30]。HOU等[21]用聚合物渗透的无定型TNTs制作类牙周膜韧带样种植体周围韧带，结果显示该结构能增加18%以上的骨结合，并将种植体传导至周围骨组织的有效应力降低30%，防止超负荷引起的骨吸收。CHEN等[31]应用电泳融合(electrophoretic fusion，EPF)方法将Ⅰ型胶原(Col-Ⅰ)垂直融合成纳米管阵列(TNTs-ColEPF)，指出具有垂直Col-Ⅰ表面的TNTs在刺激血小板介导的成纤维细胞募集的同时锚定成纤维细胞来源的Col-Ⅰ形成垂直的胶原集合体，此外该涂层表面对促炎性肿瘤坏死因子-α的释放有轻微的促进作用，但对组织再生因子如PDGF-AB、转化生长因子-β和血管内皮生长因子的刺激作用显著，说明TNTs-ColEPF表面通过建立牢固的软组织密封，能够减少种植体的并发症。当TNTs-ColEPF延伸到种植体上时，可以获得坚固而灵活的种植体牙周韧带状悬浮物，通过EPF附着在钛表面的胶原蛋白可用于预防和作为跨黏膜种植体的抗炎治疗。TNTs-ColEPF表面能抑制上皮细胞的初始黏附，其与胶原纤维的垂直黏附可防止上皮细胞向下生长[32]。

2.2 抗菌性 IM等[33]用电喷雾沉积法在TNTs上沉积聚乳酸-乙醇酸共聚物，并在其上负载四环素纳米颗粒以应对种植体感染等问题，结果表明四环素纳米颗粒包裹的TNTs具有抗金黄色葡萄球菌活性和前成骨细胞MC3T3-E1的生物相容性，TNTs的成骨活性被保留。与传统抗生素相比，抗菌肽的杀菌机制更快且细菌极难产生抗药性[34]。KAZEMZADEH-NARBAT等[35]在TNTs、磷酸钙涂层和磷脂层的垂直三层结构上浸渍一种高效的抗菌肽，发现该涂层对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有良好的抗菌活性且对成骨细胞MG63无细胞毒性。FENG等[36]将穿心莲脂负载到TNTs中，结果显示穿心莲内酯负载的TNTs能显著地对抗葡萄球菌形成的外层生物膜以控制感染。

3 药物递送

种植术后感染常常会导致种植失败，传统的给药方式存在许多缺点和局限性，如生物分布性差、治疗效率低、副作用大、药物溶解性差以及容易造成细菌耐药性等，采用局部给药方式能够提高局部用药部分的药物浓度，有效地控制感染的发生[37]。TNTs作为新型载药系统，其尺寸、几何构型及药物释放方式可以通过不同方法调控，且TNTs具有高比表面积和高载药量等优点，在药物释放方面具有广阔的应用前景[38]。目前主要使用物理吸附、电泳沉积和磁控溅射等多种技术将具有抗菌和成骨作用的元素或分子负载到TNTs中以促进骨整合及控制感染，但TNTs的突释行为会导致局部药物浓度过高而引起细胞毒性，不利于周围组织健康，可通过改变纳米管的尺寸、表面修饰、聚合物包封及刺激响应等方法延缓药物的释放[39]。目前关于纳米管尺寸及表面修饰方法以控制药物释放的研究已有大量报道[40-42]，本文主要从聚合物包封和刺激响应两方面进行阐述。

3.1 聚合物包封 RAHNAMAEE等[43]在TNTs上负载万古霉素并将还原石墨烯(reduced graphene oxide，RGO)和CH组装在TNTs上形成多功能涂层，研究纯钛组、TNTs组、TNTs/CH组、TNTs/RGO组及TNTs-RGO/CH组的药物释放行为，结果表明RGO对万古霉素的释放有轻微的抑制作用，培养20 d后TNTs组药物完全释放，而TNTs/CH组和TNTs-RGO/CH组的累积释放率分别为87%和88%，TNTs/CH组和TNTs-RGO/CH组的药物持续释放至31 d。HASHEMI等[44]在TNTs上负载糖尿病药物二甲双胍，并在TNTs上旋涂CH以形成具有可持续药物凝胶特性的表面，结果显示与对照组相比，CH包覆的TNTs药物释放时间由3 d延长至20 d，突释行为由85%降低至7%，实现药物可持续释放。

3.2 载药刺激性反应释放策略

3.2.1 pH响应性释放策略 细菌感染后的局部微环境为弱酸性(pH≤6.0)，低于正常组织(pH=7.4)，因此可利用细菌感染部位和正常组织之间的pH差作为触发信号开放药物输送平台[45]。YIN等[10]将TNTs制备成“潘多拉盒子”，然后将抗菌肽HHC36置入盒内并用pH响应的分子门聚甲基丙烯酸封闭，该分子门在生理条件下膨胀关闭延缓抗菌肽的释放，但在细菌感染时(pH≤6.0)时分子门坍塌打开以释放抗菌肽杀菌，与对照组相比，实验组50%和90%释放时间分别增加了近20倍和7倍，即72 h和168 h。TAO等[46]将骨形态发生蛋白2负载在TNTs上，用海藻酸双醛庆大霉素和CH组成pH响应的多层膜模拟生理环境(pH=7.4)和感染微环境(pH=5.8)进行药物释放行为研究，结果表明当pH=7.4时，仅有17.0μg庆大霉素从多层膜中释放，而在pH=5.8的条件下，释放的庆大霉素达38.1μg。关于药物长期分布方面，在pH=7.4和pH=5.8中培养10 d后，该多层膜中分别释放出约44.0和130.3μg庆大霉素，以上结果均表明，该多层具有较好的pH响应性。

3.2.2 酶响应性释放策略 透明质酸具有高度亲水性，有助于蛋白排斥及抗微生物定植。临床病原菌尤其是金黄色葡萄球菌在感染阶段会分泌高浓度的特异性酶，如透明质酸酶(hyluronidase，HAase)和糜蛋白酶[47]。YU等[48]在负载去铁胺的TNTs上构建透明质酸-庆大霉素偶联物(hyaluronic acid-gentamicin conjugates，HA-Gen)及CH聚电解质多层膜，指出HA-Gen对细菌具有抗黏附能力，可通过细菌定制期间分泌的HAase降解，释放出庆大霉素片段杀灭细菌，且该涂层在无HAase的情况下，去铁胺释药曲线稳定适中，而在外源性HAase的作用下，底物在最初12 h内出现突发性释放，24 h内几乎完全释放，说明该涂层可以实现去铁胺的突发释放和按需投放。YUAN等[49]以含有万古霉素的TNTs为载体，在钛基底上制备由多巴胺修饰的HA和3,4-二羟基肉桂酸修饰的CH组成的邻苯二酚功能化多层膜，于三种浓度下(0.01 mg/mL、0.05 mg/mL和0.5 mg/mL)观察该涂层的药物释放行为，结果表明在没有HAase的情况下，对照组释放量达75%，而实验组释放量不到10%，此外实验组的万古霉素释放度在12 h后减慢，在72 h后释放峰值约达90%，说明该涂层具有快速酶响应性，避免了正常组织中不必要的毒副作用。

4 总结

目前，国内外学者对TNTs在口腔种植领域应用方面已经做了大量的研究，通过改性方法对TNTs的复合处理越来越受到重视。TNTs具有良好的生物相容和局部药物释放能力，可以改善骨免疫条件、促进成骨和改善软组织封闭，适当功能化的TNTs能够解决骨结合不良、炎症和感染等问题。生物活性涂层TNTs常与其他生物活性元素或杀菌剂结合在一起，以实现骨整合和抗菌活性等多种功能。但是，TNTs作为抗菌剂载体，仍存在药物难以控制突释行为及细菌耐药性等问题，需要进一步寻找抗菌活性和再生能力之间平衡的方法。