miRNAs在缺血性脑卒中中的相关研究进展

罗雪颜，杨锡彤 综述 王光明 审校

大理大学第一附属医院基因检测中心，云南 大理 671000

脑卒中(stroke)是一种严重威胁人类身体健康的脑血管疾病，是目前全球第二大死亡率和第三大高致残率的疾病，在中国脑卒中比例呈现年轻化并逐年上升的趋势，已成为我国首位致残和致死原因[1]。脑卒中分为缺血性脑卒中(ischemic stroke，IS)和出血性脑卒中(hemorrhagic infarction，HI)，IS是由于大脑的血液供应中断导致脑组织缺氧和营养物质短缺而引发的血管堵塞，最终导致脑组织缺血、缺氧及神经功能障碍。目前的研究发现IS是脑卒中的主要类型，约占脑卒中85%以上[2]。目前，辅助监测疾病进展和预测未来事件的诊断工具和生物标记物有限仍然是脑卒中医学领域的主要挑战。因此，尽早地明确IS发病机制并及时进行干预，减少IS患者人数是预防脑卒中的关键。

微小RNA(miRNAs)为一种单链非编码RNA，目前有研究表明miRNA作为IS重要的调控因子，参与缺血性神经组织炎症反应的发生和调控，对IS的神经保护和新生血管生成具有潜在应用价值。目前对脑缺血再灌注损伤的研究已经提升到了基因分子水平，miRNAs是十分重要的基因水平调控因子，可以通过分子靶基因和目的基因相关联来体现IS的表达变化。此外，miRNAs在血液样本中便于检测且趋于稳定，可作为早期生物学标志物，为IS的预防、诊断和预后提供参考。本文就miRNAs的分子生物学特征在IS中的作用机制以及生物学应用研究进展进行综述。

1 miRNAs的分子生物学特征

miRNAs是由20～25个核苷酸组成的小型非编码RNA，通过完全或不完全碱基互补配对原则与特定靶基因的3'-非翻译区或5'-UTR结合，抑制miRNAs的翻译或直接降解特定的miRNAs，在基因转录调控和生物体正常发育过程中发挥重要的作用[3]。miRNAs可以调节信使RNA(mRNA)中的“碱基对互补序列”，特别是通过“翻译抑制”导致基因活性受损。还参与调节IS危险因素的分子，这些分子参与IS的基本病理生理过程，即细胞周期控制、细胞代谢、细胞凋亡和免疫反应等。此外，miRNAs还参与神经系统疾病、心血管疾病、造血障碍、炎症反应等多种疾病的发生和预后。尤其是miRNAs参与IS后新生血管生成和神经元损伤后保护，能较早的反映IS患者的病理生理变化。

2 miRNAs与IS的相关性

研究表明IS很大程度是由动脉粥样硬化引起的，在IS发病后，由于脑组织缺乏葡萄糖和缺氧导致缺血性神经功能缺损，IS中异常表达的miRNAs与神经元损伤后保护、炎症因子释放减少以及调节小胶质细胞活化等密切相关[4]。大脑中的免疫细胞和小胶质细胞被激活后诱发初级炎症反应，之后它们通过受损的血脑屏障介导外周免疫细胞进入脑实质，加剧炎症反应。机体会产生一些miRNAs通过减少神经元凋亡、减少炎症因子的释放来减轻炎症反应，从而发挥神经元保护作用。越来越多的研究表明，miRNAs是血管内皮细胞生物学和血管生成的重要决定因素，也是IS发病机制的重要因素[5]。此外，IS后细胞膜通透性改变出现脑水肿，miRNAs可通过不同通路保护神经元，抑制脑组织水肿。IS患者容易患上认知异常、痴呆、阿尔茨海默氏病、抑郁症等疾病，极大地加重了患者的生活负担。与其他缺血机制中讨论的miRNAs相似，血管通畅有助于缺血区血供的恢复，减少脑梗死面积是治疗缺血性脑损伤最有效的方法，因此增加保护性miRNAs并诱导抗炎性miRNAs可以有效减少缺血性脑损伤，有助于患者的临床康复。

3 miRNAs在IS中的调控作用

miRNAs作为转录后基因沉默的重要媒介，在大脑发育的生理学和IS的病理学中均发挥显著作用。在IS发生后，患者的脑组织会发生缺血缺氧的情况，导致炎症介质的分泌和炎症级联反应的发生，在病程发展过程中会出现氧化应激反应、能量衰竭及兴奋性毒性、血脑屏障紊乱和脑水肿等一系列的病理性改变，机体也会产生大量的活性氧等氧化性高的物质诱导神经元凋亡，最终导致继发性脑损伤[6]。miRNAs作为IS炎症反应中重要的调控因子，参与缺血神经组织炎症反应的发生和调控以及IS的神经元保护、新生血管生成。脑缺血/再灌注后小胶质细胞被启动，在神经炎症中起双重作用，M1型小胶质细胞表达促炎性细胞因子，引起继发性神经元损伤；在脑卒中发作的急性期M2型小胶质细胞表达抑炎性细胞因子，抑制神经炎症和修复组织，在髓鞘形成和再形成、神经元再生和血管再形成过程中发挥关键作用[7]。ZHAO等[8]研究发现来自间充质干细胞的外泌体过度表达miR-223-3P，减少了大脑中动脉闭塞/再灌注模型引起的脑梗死体积，通过抑制小胶质细胞M1极化介导的促炎反应从而减轻脑缺血再灌注损伤，改善神经功能损伤，促进学习和记忆能力。研究表明，mi RNAs在脑缺血后调节氧化剂和抗氧化剂之间的平衡中起着至关重要的作用，mi R-424、mi R-23a-3p和mi R-99a的过表达可减轻氧化应激，在缺血性损伤后保护大脑[9]。此外，IS的直接影响包括能量衰竭和兴奋性毒性，在局部缺血期间，谷氨酸的过度释放和谷氨酸转运蛋白的转运失败导致谷氨酸受体过度活化和兴奋性毒性神经元死亡。还有研究表明脑缺血后miR-107表达水平升高和星形细胞谷氨酸转运蛋白1(GLT1)表达水平降低对IS影响显著，miR-107表达上调通过诱导IS后GLT-1表达下调而促进兴奋性神经毒性[10]。

一些miRNAs与IS诱发的脑水肿有关，脑水肿是脑缺血死亡的独立预测因子之一，而BBB功能和结构的损害是血管性脑水肿的病理基础，IS后脑水肿通过增加颅内压和减少大脑组织内的血液供应而导致生理恶化。IS诱发的脑水肿也可能是血管性的，在生理水平上，脑水肿由内皮功能障碍、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)和水通道蛋白(AQP)介导，有研究发现AQP4是miR-29b的靶标，在局部缺血小鼠模型BBB破坏时，miR-29b的过表达显著减轻了AQP4的表达及脑水肿和梗死体积的减少[11]，这表明与IS后脑水肿相关的miRNAs与AQP表达相关。

IS发生后，神经元发生坏死和凋亡导致细胞死亡,miRNAs通过负向调控促凋亡或抗凋亡基因，在IS后的凋亡中发挥效应。到目前为止，许多miRNAs包括miR-21、miR-25、miR-181c和miR-210作为凋亡的分子，而miR-124、miR-181和miR-29b促进细胞凋亡[12]。miR-339通过靶向FGF9/CACNG2并介导IS的MAPK途径来促进缺氧诱导的神经元凋亡并损害细胞活力[13]。利用缺血再灌注脑损伤和兴奋性毒性神经元死亡的体内外模型，CHEN等[14]发现miR-223是一种神经元保护microRNAs，以保护卒中和其他兴奋性毒性神经元疾病中的神经元细胞死亡，与急性IS的发生、脑卒中的严重性和短期预后相关。包括miR-181a、miR-497、miR-9、miR-200和miR-124a在内的多种miRNAs通过Bcl-2家族蛋白调节细胞存活，特别是IS后神经元祖细胞中过表达的miR-124a显著降低并促进了神经元分化[15]。LI等[16]的研究表明，miRNA-451保护神经元免受缺血性损伤诱导的细胞死亡。在小鼠研究中，miR-137通过抑制Src依赖性MAPK信号传导途径来减弱氧化、凋亡和炎性途径，从而对IS的神经元起保护作用[17]。

最近的研究表明，增强新生血管的形成是治疗IS的一种有效策略。IS后血管新生促进侧支循环，恢复缺血区血供，减少缺血损伤引起的缺血坏死，可有效逆转神经损伤。GAN等[18]发现miRNAs借助IncRNA作为ceRNA从而调节靶mRNA的表达，进一步影响新生血管生成过程，例如沉默的MEG8通过靶向miR-130a-5p抑制BMEC活力，迁移血管生成。此外，MEG8可以通过miR-130a-5p/VEGFA轴促进IS后的血管生成，从而保护BMEC免受OGD诱导的损伤[19]。另一项研究显示，在OGD/R诱导的HBMEC中，MALAT1表达增加，上调的MALAT1通过靶向OGD/R条件下的HBMEC中的miR-205-5p/VEGFA信号传导，促进细胞增殖并在血管生成中起保护作用[20]。这些研究表明miRNAs转录后表达的复杂性和多样性，使其在细胞的生物学过程、神经元的分化发育和保护性血管生成方面具有一定的作用，因此，增加保护性miRNAs并诱导抗炎性miRNAs可以有效减少缺血性脑损伤并有助于临床康复。

4 miRNAs在IS中的应用

目前，IS的诊断和预后主要依靠放射成像检测手段，影像学检测有一定的局限性，并且有较高的费用。因此，需要一种更快速、简便的急性IS检测方法。miRNAs是一种小型非编码RNA分子，在血液样本中具有易于检测、趋于稳定、组织特异性较强、平均半衰期较长等优点，在IS发生后短时间内可在血液中检测到miRNAs表达水平上调或者下调，可依据IS患者miRNAs表达的高低作为IS患者早期的生物学标志物之一。评估IS的早期征兆可判定危险因素以便进一步管理与IS风险直接相关的疾病。

多种miRNAs与IS的发病机制有相关性，包括miR-155、miR-33、miR-144、miR-223和miR-21，其中miR-126、miR-320b已被提出作为IS的潜在预测标志物[21]。利用人源化小鼠大脑中动脉闭塞(MCAO)模型，ZHAO等[22]研究发现，circ_0072309-miR-100-mTOR调节轴可以减轻IS的症状，可能是IS治疗潜在的靶标。近年来，血液检查中生物学标志物miRNAs的发现和使用在急性脑卒中患者中成为一个有吸引力的研究方向。通过采用逐步发现、验证和复制的方法对miRNAs进行评估，发现miR-125a-5p、miR-125b-5p和miR-143-3p的组合具有显著的敏感性(85.6%)和特异性(76.3%)，可作为IS生物学标志物之一[23]。miR-223是谷氨酸受体表达和功能的主要调节因子，在神经元存活中起着重要作用，但仍需要大量的研究确定miR-223作为IS诊断的新型生物标志物的临床应用[24]。据报道，在大鼠模型的缺血/再灌注期间，有部分miRNAs如miR-206、miR-214、miR-223、miR-298、miR-327和miR-494出现过表达[24]，检测miRNAs过表达可作为预测IS发生的重要手段之一。此外，miRNAs通过与其他基因组，例如蛋白质组和代谢组数据结合起来生成转录组数据库，获取可用的miRNAs谱。miRNAs与患者的其他临床信息(例如年龄、治疗发作、NIHSS评分、既往高血压、心脏病和糖尿病等)也可以结合起来用作预后因素，对脑卒中患者的可用电子健康记录(EHR)进行解释。

针对IS的治疗，到目前为止，重组组织纤溶酶原启动剂(tPA)是FDA批准的唯一治疗IS的药物，但是，tPA的使用主要受到治疗时间窗较短的影响，只能在脑卒中发作后4.5 h内给予。大脑中动脉近端闭塞的患者可以接受血管内干预，但至今，尚无有效的治疗方法针对早期不能修复血管的患者[18]。有研究表明miRNAs作为脑血管疾病的靶点成为当前的研究热点，目前的治疗策略主要有以下两种方向，第一：通过抗miRNAs技术下调高表达的miRNAs，一些miRNAs在IS后表达异常升高，加重缺血后神经损伤、脑梗死面积、炎症等反应，例如miR-200c、miR-181a等。通过利用抗miRNAs技术(包括miRNAs拮抗剂和miRNAs诱饵打靶法)抑制此类miRNAs减少来减轻IS损伤。第二：通过miRNAs模拟技术上调miRNAs的表达，一些miRNAs对神经元系统表现出明显的保护作用，提高这些miRNAs的表达可以达到相关的治疗作用，例如miR-124a、miR-451a等[2/5]。李文彦等[16]研究发现miRNA-451在小鼠脑缺血再灌注模型中表达下调，通过TLR4/MyD88/NF-κB信号通路降低体外脑缺血再灌注模型的炎症反应提示miRNA-451可能开发用于脑缺血再灌注治疗药物的靶点。数据表明，锂通过BDNF-AS/miR-9-5p轴减少IS诱导的细胞凋亡和炎症，抑制miR-9-5p或miR-128-3p可以显著降低MCAO诱导的侵袭体积并抑制凋亡反应[26]。通过缝合法建立大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型和MEG8过表达MCAO模型研究发现：miR-130a-5p下调，而MEG8上调后通过miR-130a-5p/VEGFA信号传导调节IS后血管生成，减轻脑出血[19]。MiR-29b可以损害Bcl-2基因的表达并增加神经元细胞的死亡，通过下调MiR-29b的高表达提示一种针对IS损伤的新治疗靶点[24]。然而一些miRNAs的作用机制与之相反，miR-221通过抑制促炎反应来减轻急性IS的脑损伤，上调miR-221的表达可为IS的治疗提供了新的靶点[27]。miR-190通过调节Rho/Rho激酶信号传导而赋予针对小鼠心肌缺血/再灌注模型(ischemia reperfusion，I/R)损伤的保护，上调其表达显著降低了患有I/R的大鼠的神经学评分、脑含水量、梗塞体积和神经元凋亡，因此，miR-3552有望成为IS大鼠的潜在生物学治疗靶点[28]。通过实验评估，JIN等[29]发现上调的miR-126和miR-130a水平与IS患者的疾病风险、严重程度和炎症性细胞因子水平降低有关，这将有益于开发新的IS治疗方向。这些发现证明了miRNAs转录后调控的复杂性，可以通过改变其表达对细胞生存或者死亡产生影响。因此，miRNAs作为新的生物标志物和卒中治疗干预的潜在靶点具有良好的应用前景。

5 结语

综上所述，miRNAs因其序列结构和表达方式的多样性而成为miRNAs的重要调节因子，本文通过阐述miRNAs与IS作用机制的紧密联系，以便更好地了解IS机制中miRNAs及其靶基因的发现对IS患者预测、诊疗、预后存在更大的潜在作用。miRNAs及其靶基因参与了IS的新生血管生成、神经元再生和神经保护等，可能作为IS的新型疗法而推广用于临床试验，同时，miRNAs作为治疗方案的作用被预测为双刃剑法，miRNAs也有望成为IS的重要预测、诊断和治疗靶标。