基于网络药理学和分子对接法的四物汤治疗肾性贫血的分子机制研究

何爽，王喜红，陈梦琳，张兴华，唐阁*

（1.天津中医药大学第一附属医院肾病科，天津 300193；2.国家中医针灸临床医学研究中心，天津 300193）

0 引言

肾性贫血是由促红细胞生成素缺乏所导致的正色素正细胞性贫血，是慢性肾脏病（chronic kidney disease,CKD）的常见并发症[1]，也是CKD患者合并心血管并发症的独立危险因素[2]。当肾小球滤过率降至60m L/(min·1.73m2)以下时，疾病进展速度加快，并且肾小球滤过率越低，病情越严重。该病多发生于CKD4-5期患者，其中CKD4期患者的发病率约为50%，终末期肾脏病患者的发病率更是高达90%以上。纠正贫血可在一定程度上降低CKD患者死亡率、住院率，同时提高患者的生活质量[3]。

近年来，随着肾性贫血中医病因病机的研究不断深入，中医药治疗肾性贫血取得了较大进展。中药复方在治疗肾性贫血方面具有多靶点、整体调治、安全性高的显著优势。四物汤作为补血调血的基础方，已被广泛应用于各种类型的贫血[4-6]。本研究基于网络药理学分析四物汤（组成分别为当归、川芎、白芍、熟地黄）的有效活性成分及作用靶点，探究其治疗肾性贫血的潜在作用机制，以期为后续的临床及实验研究提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 四物汤相关靶点的收集

通过中医药系统药理学平台TCMSP（old.tcmsp-e.com/tcmsp.p hp）分别检索当归、川芎、白芍、熟地黄四味中药，以口服利用度（OB）≥30%，且类药性（DL）≥0.18为标准，对有效活性成分及其对应靶点蛋白进行筛选，筛选后根据已发表的文献补充未检测到的靶点。完成上述步骤后在Unip rot数据库（https://w w w.uniprot.org/）进行蛋白和基因的标准化转换。

1.2 四物汤治疗肾性贫血相关靶点的筛选

通过人类基因数据库G e n e C a r d s（http s://w w w.genecard s.org）和人类基因和遗传疾病数据库OMIM（http s://w w w.omim.org），以“Renal anemia”为关键词进行检索，同时利用DrugBank数据库（https://go.d rugbank.com）对疾病基因进行补充，去除重复项得到最终的肾性贫血相关基因，并与药物成分的相应靶点取交集，所得到的交集基因即是四物汤治疗肾性贫血的潜在作用靶点。

1.3 四物汤成分—肾性贫血靶点的PPI网络构建

将得到的交集基因通过S t r i n g数据库（https://string-db.org）进行生物信息分析。利用Cytoscape 3.7.2软件构建药物有效成分—疾病—靶点的蛋白互作（PPI）的可视化网络。

1.4 四物汤成分—肾性贫血靶点功能与通路的富集分析

将四物汤治疗肾性贫血的靶点导入Metascape数据库（https://metascape.org）进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，借助微生信（w w w.bioinformatics.com.cn）对其结果进行可视化处理，分析四物汤治疗肾性贫血的潜在机制。

1.5 分子对接验证

根据Degr ee值筛选出排名前3的核心靶点与频次最高的3个关键成分，分别在PDB数据库(http://w w w.p d b.org/)下载蛋白的3D结构、Pubchem数据库（http s://p ubchem.ncbi.nlm.nih.gov）下载有效成分的2D结构，利用Auto Dock和Pymol软件对四物汤中的主要成分和核心靶点进行分子对接，对其结合活性进行分子验证。一般结合能越小，分子对接结果越好，当结合能≤-5 k J/mol，提示核心靶点与有效成分间的结合活性较好[7]。

2 结果

2.1 四物汤的化学活性成分与肾性贫血的相关靶点

通过对当归、川芎、白芍、熟地黄的有效成分进行检索，共获得18个有效成分，分别为β-谷甾醇、豆甾醇、Mand enol、杨梅酮、黑麦草碱、川芎萘呋内酯、谷甾醇、甲酰胺、芍药黄酮、(3S,5R,8R,9R,10S,14S)-3,17-d ihyd roxy-4,4,8,10,14-p entamethyl-2,3,5,6,7,9-hexahy d r o-1H-cy clop enta[a]p henanthrene-15,16-d ione、芍药苷、丁子香萜、山柰酚、(+)-catechin。共获得245个靶点，合并后4删除重复值共得到靶点105个。通过Gene Card s、OMIM和Drugbank数据库以“Renal anemia”为关键词进行检索，经过合并及删除重复靶点后共获得1834个肾形贫血相关靶点。

表1 四物汤中主要活性成分

2.2 四物汤成分—肾性贫血相关靶点PPI网络

将筛选出的105个药物成分靶点与1834个疾病靶点取交集，获得36个共同靶点，韦恩图显示结果如下，见图1。将共同靶点输入至string平台，得到四物汤治疗肾性贫血靶点的PPI网络。通过Cytoscap e 3.7.2软件将结果根据Degree值调节进行进一步处理，得到一个具有36个节点，298条边的可视化网络，见图2。

图1 四物汤成分与肾性贫血相关靶点韦恩图

图2 四物汤与肾性贫血的可视化PPI网络

2.3 靶点功能与通路的富集分析

将四物汤治疗肾性贫血的靶点导入Metascap e数据库，进行GO功能富集分析，共获得的生物过程(Biological Process,BP)有712条，细胞组成(Cell Composition,CC)有24条，分子功能(Molecular Function,MF)有58条，按校正P值分别取BP、CC、MF排名的前10条，共计30条，主要与对细菌来源的分子的反应、对脂多糖的反应、对无机物的反应等生物功能有关，见图3。对四物汤治疗肾性贫血的靶点进行KEGG通路富集分析，共获得126条通路，按校正P值排名取前30条通路在微生信进行可视化，其中点越大表示富集基因数越多，颜色越红表示四物汤对肾性贫血的干预越密切，由图可知，其机制主要与脂质和动脉粥样硬化、AGE-RAGE等通路有关，绘图后显示如下，见图4。

图3 GO功能富集分析

图4 KEGG通路富集分析

2.4 分子对接验证

利用AutoDock和Pymol软件对排名前3的活性成分β-谷甾醇、豆甾醇、山柰酚和排名前三的核心靶点IL-6、AKT1、TNF，分别进行分子对接。具体对接结果如下，见表2，由表2可知四物汤有效成分β-谷甾醇、豆甾醇、山柰酚和核心靶点IL-6、AKT1、TNF的结合能均≤-5 k J/mol，表明本研究中有效成分与核心靶点对接活性较好，可能是四物汤治疗肾性贫血的主要有效活性成分；其中豆甾醇与AKT1结合力最强，其次是豆甾醇与IL-6、豆甾醇与TNF，分子对接结果见图5。

表2 核心靶点与活性成分对接结果—最低结合能（kJ·mol-1）

AKT1与豆甾醇对接情况

IL-6与豆甾醇对接情况

TNF与豆甾醇对接情况图5分子对接结果

3 讨论

肾性贫血是CKD中后期较为常见的并发症，亦是导致CKD患者心血管风险的独立危险因素。目前临床上主要使用促红细胞生成素（erythrop oietin,EPO）或EPO类似物，但可能诱发心血管事件、高钾血症和感染等并发症，并增加死亡风险[8]。中药在改善肾性贫血的临床症状方面有极大潜力。贾梅等[9]在实验中证实四物汤可改善小鼠的外周血象、免疫器官指数及红细胞膜能量代谢酶活力，起到较好补血的作用。在肾性贫血的临床研究中，梁同衍等[10]证实四物汤不仅可升高维持性血液透析患者的血红蛋白水平，亦可降低C反应蛋白、IL-6水平，即改善患者的微炎症状态，从而间接发挥改善肾性贫血的作用。

本研究通过网络药理学筛选得到四物汤18种有效活性成分，其中β-谷甾醇、豆甾醇、山柰酚可能是发挥防治肾性贫血作用的关键成分。CKD患者中后期常伴有不同程度的贫血，炎症反应是CKD患者贫血加重的独立危险因素[2]，而β-谷甾醇、豆甾醇、山柰酚均具有抗炎作用[11-13]。炎症反应时铁代谢紊乱，巨噬细胞内铁滞留，最终导致红细胞半衰期减少，EPO功能和红细胞祖细胞分化受抑制[14]。豆甾醇可通过降低炎症因子IL-1β和TNF-α水平，升高抗炎因子IL-10水平，以达到抗炎，减轻贫血的作用[12]。山柰酚可通过增加巨噬细胞数量，抑制脂多糖（LPS）诱导的TNF-α和IL-1的表达，抑制TNF-α介导NF-κB p65向细胞核的易位，起到抗炎作用，进而减轻贫血的作用[15]。β-谷甾醇在抗氧化方面的治疗具有较大潜力，可显著降低谷胱甘肽过氧化物酶和Mn超氧化物歧化酶活性，减缓红细胞老化，从而起到减轻贫血的作用[16,17]。上述关键成分均可通过抑制炎症反应，发挥减轻贫血的作用。另有研究显示，β-谷甾醇是一种植物固醇，可通过抑制促炎细胞因子、TNF-α的分泌，同时激活抗炎细胞因子，进而发挥抑制EPO细胞凋亡，减轻肾性贫血发生的作用[16,18]。

从靶点角度考虑，IL-6、AKT1、TNF在PPI网络中处于核心位置，可能是四物汤治疗肾性贫血的核心作用靶点。四物汤中大多数活性成分作用于靶点IL-6。该成分可通过诱导肝素导致红细胞生成中的铁供应减少，促进肾性贫血的发展[19]。一项实验研究得出IL-6导致贫血的机制或与肝素的激活、肾纤维化的加重、EPO轴的改变和红细胞破坏的激活有关，并提出有必要对IL-6进一步研究[20]。TNF是机体的另一重要炎性因子，当其升高时亦可加重炎症反应，进而促进贫血的发生、发展[21]。CKD患者长期处于微炎症状态，分析可知，此状态是贫血加重的原因之一。AKT是PI3K/AKT/m TOR信号通路的枢纽，此通路广泛参与干细胞的代谢、生长、增殖和存活，与造血干细胞密切相关[22,23]。分子对接结果表明主要活性成分与关键靶点结合较强，亲和力较好，进一步验证了此次研究的可靠性。

通过对GO功能富集分析和KEGG通路富集分析的结果可知，GO功能富集结果显示四物汤治疗肾性贫血的机制主要与刺激反应、氧化应激等生物过程有关。KEGG通路富集结果显示四物汤治疗肾性贫血的机制主要与调控脂质和动脉粥样硬化、AGE-RAGE等信号通路有关。脂质和动脉粥样硬化通路是慢性肾衰竭合并心血管风险的主要因素，心血管疾病可加快CKD进展，进而加重贫血，即脂质和动脉粥样硬化通路可间接导致贫血的发生[24]。AGERAGE信号通路可通过诱导肾小球硬化和间质纤维化来加快CKD进展，进而增加贫血的发生率[25]。此外，炎症是肾性贫血发生、发展的重要原因，AGE-RAGE信号通路与炎症密切相关，四物汤中的有效成分可通过调控此通路激活的炎症通道，抑制炎症反应，达到改善贫血的作用[26]。因此，推测四物汤通过调控脂质和动脉粥样硬化、AGE-RAGE等信号通路，作用于IL-6、AKT1、TNF等核心靶点而发挥治疗肾性贫血的作用。

综上，研究结果表明四物汤治疗肾性贫血具有多成分、多靶点、多通路的特点。本研究基于网络药理学的方法，从分子水平初步探讨四物汤治疗肾性贫血的主要有效活性成分、关键靶点及信号通路，初步阐述四物汤治疗肾性贫血的作用机制，为临床治疗肾性贫血提供理论依据，也为中药复方治疗肾性贫血提供新的方法和思路。本研究还存在一定的局限性，研究结果仅仅基于生物信息学与数据计算的结果，初步解释四物汤治疗肾形贫血的机制，并未进行相关的动物、细胞实验；其次，数据库数据尚不完善、更新周期较长。为了进一步验证此结果，还需要大量的基础研究。