核糖体蛋白S15a在鼻咽癌组织中的表达及临床意义

钮燕，白忠，吴海莺，吕操，曹守明，马燕，宁金梅

（1.昆明医科大学第二附属医院耳鼻咽喉科，云南 昆明 650000；2.云南省曲靖市第一人民医院耳鼻咽喉科，云南 曲靖 655000）

0 引言

对于真核生物核糖体而言，其组成分为两大部分，分别为79种核糖体蛋白（ribosomal protein,RP）、4种 核 糖 体RNA（ribosomal RNA，rRNA）。有相关的研究指出，在核糖体形成，蛋白质合成中，前者均扮演着重要的角色，且参与转录、翻译调控、免疫细胞恶性转化等较多的生理与病理过程及变化[1]。已经发现某些RP在众多类型肿瘤中表达量升高，过表达的RP可能起到促进肿瘤作用，某些RP在鼻咽癌组织中的表达异常，但就目前的相关研究来看，在鼻咽癌组织中，针对核糖体蛋白S15a（ribosomal protein S15a，RPS15a）的相关表达与功能研究文献较少。故而笔者开展此次研究具有较高的意义，首先针对RPS15a在鼻咽癌组织中的表达展开了分析，并进一步分析了RPS15a不同表达水平与此类疾病患者相关临床指标之间的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料

所有标本来自昆明医科大学第二附属医院2016年10月至2019年12月因鼻咽部肿块就诊患者107例，对所有的患者标本实施病理检查，均确诊低分化鳞癌（107例患者的相关标本在取材前均未实施相关的治疗，包括放化疗）。随机选取30例鼻咽部肿块患者，取鼻咽部病变旁0.8-1cm的无肿瘤组织，对所取的组织实施病理诊断，均确诊为癌旁正常组织，且均未经癌细胞浸润。需要注意的是，上述所提到的组织标本保存待检方法为：活检后用氯化钠溶液冲洗表面残留血迹，置入冷冻管后，放入液氮罐或-80℃冰箱保存备用；而且均在活检前对患者进行告知，得到其同意后实施。昆明医科大学第二附属医院医学伦理学委员会已经对此次研究实施了相关审查，其结果显示为通过。

1.2 主要试剂

兔抗RPS15a多克隆抗体由美国赛默飞世尔科技Invitrogen公司提供，工作浓度1:100。二甲苯、中性树胶由国药集团提供，0.1%triton-100X由Sigma（上海）贸易有限公司提供，山羊血清由恒远生物公司提供，苏木素由珠海贝索生物技术公司提供，0.25%盐酸酒精、柠檬酸抗原修复液由迈新公司提供，EDTA 抗原修复液由碧云天公司提供，1xPBST 洗液为实验室自配，3%过氧化氢溶液、100%乙醇、75%乙醇实验室自有。

1.3 RPs15a表达的检测

严格按照试剂盒说明书中的操作标准与相关流程、步骤等开展常规免疫组织化学SP法检测。首先，将烤箱设置为65℃、30min后，置入组织玻片进行烘烤，取出后利用二甲苯缸进行3次脱蜡处理，每次10min；利用酒精可以洗去二甲苯的作用，前后共4次置于酒精缸中，依次为100%酒精5min，100%酒精5min，100%酒精5min，75%酒精5min，流水冲洗5min；将经过上述处理后的玻片置入柠檬酸盐修复液缸中，再将缸放入高压锅内，锅内加水至缸体2/3处，管壁高压锅270℃升温煮沸至爆气，将温度调至180℃煮沸5min，关闭高压锅，保温10min，开盖取出玻片修复缸，室温冷却；将所得玻片置入1xPBS缓冲液中，浸泡时间设置为10min，根据组织大小，使用免疫组化笔画出椭圆形的隔水圈后，再次利用1xPBST缓冲液进行3次冲洗处理，每次时间均为5min，使用3%过氧化氢溶液封闭内源性过氧化物酶5min，再次进行冲洗5min处理，利用1xPBST缓冲液进行，山羊血清封闭15min，染色，选择使用1抗的浓度，1抗稀释液使用0.1%triton，加入1抗置37℃孵箱1h，将1抗反应结束的玻片使用1xPBST缓冲液清洗5min/3次，加入2抗，置37℃孵箱1h，将2抗反应结束的玻片使用1xPBST缓冲液清洗5min，共3次，之后进行避光染色处理，利用DAB染液，染色5min，此项操作结束后水洗终止染色，利用苏木素进行复染10s处理，流水冲洗之后，用0.25%盐酸酒精分色2s，再次经过流水冲洗之后，利用无水乙醇实施脱水处理，每缸2min，共计2缸，二甲苯缸浸泡，每缸2min，使用中性树胶进行封片。

1.4 结果判定标准

由北京中杉金桥生物技术有限公司提供，阴性对照品为4%免疫前羊血清。RPS15a表达阳性判定标准：对组织中的细胞质、细胞核等进行仔细观察，如果出现清晰的黄色、棕黄色颗粒则判定为阳性。另外，针对每个组织标本的染色情况进行得分统计，方法为在镜下观察标本的染色强度和广度，以其乘积作为得分。其中在染色广度中，分别记为0-4分，以阳性细胞占比作为计分标准，0-4分分别为阳性 细胞 占 比＜1%、2%-25%、26%-50%、51%-75%、＞75%；在染色强度中，以其着色情况作为计分标准，0-3分分别为无着色、黄色、棕色、深褐色。最终每个组织标本的染色情况根据得分高低分为Ⅰ（0-1分）、Ⅱ（2-4分）、Ⅲ（5-8分）、Ⅳ级（9-12分），其中除Ⅰ级为阴性表达之外，Ⅱ级及以上均为阳性表达[2]。

1.5 统计学方法

此次利用软件SPSS18.0，针对RPS15a表达水平、临床相关的病例资料指标等均实施[n（%）]与χ2检验，在其对比过程中，如果对比结果差异有统计学意义则以P＜0.05表示。

2 结果

2.1 RPs15a基因在鼻咽癌组织和癌旁组织的表达

见表1。

表1 RPs15a在鼻咽癌组织及癌旁组织的免疫组化表达

RPS15a 在鼻咽癌组织中的阳性表达率为低表 达39.3%（42/107），高 表 达60.7%（65/107），在癌旁正常组织中的阳性表达率为低表达100%（30/30），未有高表达的标本，依据χ2检验分析可知，与癌旁组织相比，在鼻咽癌组织中RPS15a基因的表达相对更高(P＜0.001)。RPS15a主要表达于鼻咽黏膜的腺体，多数位于细胞胞浆，少数位于细胞核及核膜（图1、2）。

图1 癌旁组织

图2 鼻咽癌组织

2.2 RPs15a基因在鼻咽癌组织临床病理资料的表达

见表2。

表2 鼻咽癌患者RPs15a表达与肿瘤特征的关系

将患者按年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤分期、是否有复发情况、有无颈部淋巴结转移分组进行RPS15a表达阳性率比较，根据Mann-Whitney U分析可知，RPS15a基因的表达在颈部淋巴结转移中差异有统计学意义（P=0.01），与患者年龄、性别、 肿瘤大小、肿瘤分期、是否有复发情况无明显相关性。

2.3 鼻咽癌患者RPs15a表达与颈部淋巴结转移的相关性

见表3。

表3 鼻咽癌患者RPs15a表达与颈部淋巴结转移的关系

根据Spearman等级相关性分析可知，RPS15a基因的表达与颈部淋巴结转移呈正相关，即随着患者肿瘤恶性程度加深，RPS15a基因的表达随之增加。

3 讨论

鼻咽癌是一种起源于鼻咽部上皮细胞的恶性肿瘤[3]。虽然随着医学诊疗技术的进步，该疾病的生存率显著提高，但由于大部分的患者发现时已处于疾病晚期，甚至伴有不同程度的转移等，故而其治疗效果并不是十分理想。对此，笔者开展此次研究，旨在为鼻咽癌患者的早期临床诊断以及预后评估寻找到更优的生物标志物。

对于核糖体蛋白而言，其除了主要参与蛋白质的合成之外，还参与正常细胞恶性转化等[4]，因此其如果存在基因表达异常则可能会诱发疾病[5,6]。RPS15a是高保守的核糖体蛋白，其可在蛋白翻译水平中介导肿瘤发生[7]，笔者考虑，这可能是导致鼻咽癌的发生及进展的相关机制之一，而也有相关的研究指出，RPS15a可能在细胞中起着癌基因或癌基因激活剂的作用[8,9]。

在本研究中，在鼻咽癌组织中，RPS15a的阳性表达率更高，且其表达水平与患者的颈部淋巴结转移关系密切。故而提示，RPS15a基因可能在鼻咽癌的发生、发展、转移中发挥重要的作用，具有较强的诊断与预后价值，有可能作为鼻咽癌治疗的一个药物靶点。