侵袭性真菌感染非培养检测方法的进展

赵正群，帕丽达·阿布力孜指导老师）

（新疆医科大学第一附属医院，新疆 乌鲁木齐 830000）

0 引言

据估算，全球每年发展为急性侵袭性真菌感染(invasive fungal infection, IFI)的患者有近190万人，另外约有300万人患有慢性严重真菌感染，估计每年所有与真菌疾病相关的死亡率会超过约160万[1]。这些感染不仅会造成较高的发病率和死亡率，而且会带来巨大的经济负担，仅在美国，每年的治疗费用估计就超过10亿美元[2]。IFI诊断的困难不仅可能增加与这些疾病相关的诊疗费用，而且可能导致更高的死亡率。IFI的死前诊断率约为50%，范围仅为12%-60%，这取决于IFI的病因和已故患者的潜在疾病类型。这一统计中反映的诊断困难也对抗菌药的使用和日益增长的抗菌素耐药性威胁产生了重大影响[3]。因此，有必要改进与IFI诊断和治疗相关的管理，以及当前真菌诊断的成本和可及性。

根据欧洲癌症/侵袭性真菌感染研究和治疗合作小组(European Organization for Research and Treatment of Cancer/侵袭性真菌感染合作小组)和美国国家过敏和传染病研究所真菌病研究组(EORTC/MSG)的规定，目前对IFI确诊的定义需要一种微生物学和/或组织病理学诊断方法，但该定义的目的是提供清晰度和一致性，以提高临床研究的质量。在临床中，单独使用这些传统临床诊断技术受到所需标本灵敏度低、周转缓慢和侵入性的限制，而不需在培养中生长或组织中鉴定的实验室技术(例如真菌抗体、抗原和核酸检测)在与IFI相关的临床决策中却发挥着重要作用。但这些技术在推广使用、合理利用和临床性能等方面存在局限性。临床中及时诊断侵袭性真菌感染很重要，因为早期开始适当的抗真菌治疗可以明显改善患者的预后。这篇综述是介绍侵袭性真菌感染的非培养检测方法，以便于早期诊断侵袭性真菌感染。

1 真菌抗原检测技术

1.1 (1,3)-β-D-葡聚糖检测（1,3-β-D-glucan ，BDG）

BDG是曲霉属、念珠菌属、卡氏肺囊虫和其他真菌细胞壁的主要成分,而不包括隐球菌属、芽生菌属、毛霉菌。由于BDG在维持真菌细胞壁结构中的重要作用，它不仅被作为抗真菌药物研究的靶点，也成为诊断IFIs的标记物。BDG在真菌感染期间流入体液中，在对IFIs的专门检测中有一定的临床效用，尤其是在IFIs流行率低至中等的临床环境中。已经开发了几种商业检测方法，其中对Fungitell检测方法(Associates of Cape Cod, East Falmouth, MA, USA)的研究最为广泛，Fungitell检测方法是美国食品和药物管理局（the United States Food and Drug Administration ，FDA）批准的辅助诊断侵袭性真菌病的方法。Fungitell检测方法不直接测量BDG浓度，而是通过显色法或浊度法测量与BDG结合的马蹄鲎凝固级联的激活率去定量BDG的浓度。商业试剂盒使用的试剂来自不同种类的马蹄鲎，阳性结果的截止值各不相同。Fungitell试验可以在血培养阳性前几天至数周内检测出血清中低至1pg/mL的BDG水平，因此有助于区分有无IFIs的患者。血清BDG测定的准确度为76.8%-80%，特异度为63%-85.3%。连续两次BDG检测的阳性结果比用一次测量的阳性结果精度更高。

研究表明除血清外，BALF(Bronchoalveolar Lavage Fluid)和CSF(Cerebrospinal Fluid)中 的BDG检测可能对IFI的诊断具有重要的临床意义。如Mikulska等表明BDG检测在诊断不同的中枢神经系统真菌感染(包括曲霉菌病、组织胞浆菌病和一些隐球菌病)方面是有用的，且Litvintseva等人还证明了在138 pg/mL的临界值下其对于诊断真菌性脑膜炎的作用，脑脊液BDG检测的敏感性和特异性分别为100%和98%，这说明对脑脊液样本进行BDG检测的研究结果可以辅助诊断IFIs。此外，临床中也需考虑BDG检测假阳性的问题，包括念珠菌或霉菌定植、人类血液制品、血液透析或血液滤过、某些革兰氏阳性菌、某些β-内酰胺类抗生素、纤维素敷料、肠内营养、黏膜炎以及胃肠道完整性的破坏。

1.2 半乳甘露聚糖(aspergillus galactomannan,GM）

半乳甘露聚糖是多种真菌的细胞壁成分，包括曲霉属、青霉属、拟青霉属、淡紫拟青霉和组织胞浆菌。因GM分子中含有的呋喃半乳糖侧链（the Galf-containing side-chains）不是由人类产生的，故将其作为诊断真菌感染的生物标志物。曲霉属在入侵生长过程中可以释放热稳定的可溶性GM。用EIA（Platelia Aspergillus EIA；Bio-Rad，Marnesla-Coquette，France）检测GM是诊断侵袭性曲霉病的一种成熟和广泛研究的方法[4]。单克隆抗体EB-A2用双夹心ELISA以检测β-1,5-呋喃半乳糖的抗原侧链，该侧链具有带有α-1,2和α-1,6键的甘露聚糖线性核心。多个专家机构强烈建议当怀疑患者有侵袭性真菌感染(invasive pulmonary aspergillosis,IPA)时，血清GM检测可用于出现不明原因的肺浸润的严重免疫损害患者[5]。此外，其他的体液中也可检测到GM，包括支气管肺泡灌洗液、脑脊液、腹腔液和尿液等。然而，只有血清或血浆、BALF、脑脊液的GM检测获得FDA批准，目前用于侵袭性真菌感染的临床诊断或拟诊IA的患者。

血清样本GM检测的敏感性和特异性因宿主和使用的截止指数而异。在邹等人的研究中表明，BALF GM检测的最佳界值为1.0，其联合敏感性高于PCR和血清GM检测，提示BALF GM检测可作为诊断已确诊或拟诊IA的有效辅助手段。而在一项回顾性研究中，对15名确诊或临床诊断为中枢神经系统侵袭性霉菌病中的9名儿童患者进行了脑脊液GM检测，发现5名患者呈阳性结果，表明CSF GM检测作为可以辅助诊断中枢神经系统侵袭性霉菌病。最后，GM除了作为诊断标记物，还可以很好地预测IA的治疗反应和生存期。在临床的实际应用中也需要考虑假阳性结果，假阳性结果原因可能是与其他真菌的GM有交叉反应性，以及受到某些批次的β-内酰胺抗生素的GM污染（除哌拉西林/他唑巴坦外)。总之，多种临床标本进行GM检测可获得较好的临床诊断价值，且BALF GM明显优于血清GM。

1.3 隐球菌抗原检测（cryptococcal antigen detection，CrAg）

新生隐球菌在以多糖为基础的细胞壁之外，有一个独特的光环多糖荚膜，它是隐球菌疾病的诊断标志。隐球菌荚膜主要由GXM、葡聚糖氧基葡萄糖半乳聚糖(glucoronoxylomannogalactan,GXMG al)和微量甘露糖蛋白组成。GXM也是主要的隐球菌多糖荚膜抗原(cryptococcus polysaccharides capsular antigen，CrAg)，在隐球菌疾病传播的早期过程中大量释放在血液和脑脊液中。血清和脑脊液的隐球菌基线滴度与真菌组织负荷相对应，因此可作为隐球菌性脑膜炎（cryptococcal meningitis,CM）的预后标志物[6]。目前，检测CrAg的两种常用方法是乳胶凝集试验和酶免疫法，这两种方法都是FDA批准的商用方法。目前已经扩展到包括一种床旁免疫层析试纸测试，与其他商业上可获得的CrAg测试相比，该测试在脑脊液、血浆和血清样本中显示出与其他商业上可用的CrAg测试相同或更高的灵敏度和特异性的阳性结果。在高发环境下早期针对脑脊液和血液中进行隐球菌的抗原检测，可更快地达到降低隐球菌相关死亡率的效果。在脑膜炎症状出现之前的几周到几个月内，可以在血清中检测到CrAg，因此可以对无症状、有发生CM的高风险患者进行前瞻性检测。此外，在最近的一项回顾性研究中，血清CrAg试验可用于诊断CM，并可作为HIV感染合并隐球菌抗原血症患者死亡率的预测因子[7]。到目前为止，CrAg试验在BALF中的应用仍然是有限的[8]。

1.4 组织胞浆抗原检测

组织胞浆菌病是另一种IFI，它的抗原检测通常用于诊断。组织胞浆抗原检测有多个检测平台；MiraVista组织胞浆抗原定量酶免疫分析(MiraVista Diagnostics，Indianapolstics，IN)与IMMY(Norman，OK)生产的用于检测组织胞浆GM的分析物特异性试剂的比较显示，使用EIA检测组织胞浆GM的总体符合率为90%。这项研究是专门针对尿液样本进行的,最近发表的一篇关于同一患者在一周内完成的尿液和血清抗原配对检测的综述显示，两种样本类型的检测结果有98%的一致性。

1.5 结合分子和抗原检测

最常用的是GM检测和曲霉PCR诊断相结合的方法，但与单独的检测方法相比，使用率仍然相对较低，该方法使用各种基因靶标(例如，线粒体DNA、28S rRNA、18S rRNA和核糖体DNA，的内部转录间隔区来筛查高危患者群体中的IA。

2 真菌检测的新方法

2.1 T2Candida检测

念珠菌的浅表感染和侵袭性念珠菌病的诊断已使用直接检测试验。最近，FDA批准了第一个直接检测念珠菌核酸的测试(T2 Candida；T2 Biossystems，Inc.，Lexington，MA)。该方法结合靶向PCR和T2磁共振技术，能够直接从血液标本中检测出5种最常见的念珠菌，与血液培养相比，其总体特异性为99.4%(95%CI，99.1%-99.6%)，总体 敏 感 性 为91.1%(95%CI，86.9%-94.2%)。这 些发现在一项研究中得到了很大程度的证实，该研究使用了念珠菌血症患者的样本，其临床敏感度为89%[9]。这项研究的结果，与最初的临床试验结果相结合，表明无论流行率如何，阴性预测值始终很高(98%-99.9%)，但T2Candida的阳性预测值差别很大，这取决于代表的患者群体的预期流行率(15%-92%)[9]。

2.2 挥发性有机化合物(volatile organic compounds VOCs)

研究人员使用生物引导的方法识别生物标记物后，对64名疑似IFIs患者的呼吸样本进行了测试,研究人员发现，根据EORTC/MSG共识标准，与确诊和临床诊断IA参考标准相比，检测特定4-代谢物特征的任何元素可以区分IA患者和非IA患者，其灵敏度为94%(95%CI，81%-98%)，特异性为93%(95%CI，9%-98%)。然而其他的研究发现，在体外，从临床标本中培养分离的曲霉菌的挥发性有机化合物谱并不总是在同一患者的呼吸中可以被检测到[10]。Koo和他的同事提供了一个有趣的证据，支持直接检测外源真菌代谢物用于IA诊断的潜在用途。

2.3 质谱法（mass spectrometry-disaccharide，Ms-Ds）

在为IA确定新的生物标志物的类似主题中，研究人员最近利用质谱法，不仅用于培养鉴定中分离的真菌，而且还用于检测患者血清中循环的真菌分子。Senhad等人描述了一种检测和相对定量泛真菌血清二糖(disaccharide,DS)的方法，该方法随后被证明与用于IFIs诊断的商用BDG和GM检测方法具有可比性。

2.4 侧向流动免疫诊断装置

研究人员在试纸形式的侧向流动免疫诊断装置中使用了一种新型的半乳呋喃糖特异性抗烟曲霉单克隆抗体，以证明检测尿样对IA的诊断是敏感和特异的。该检测方法的灵敏度因患者群体的不同而不同。例如，在所有确诊/临床诊断IA的 患 者 中，敏 感 度 为80%(95%CI，61.4%-92.3%)，但在血液系统恶性肿瘤、骨髓移植或中性粒细胞减少症患者(n=50)和非癌症患者(n=75)中的敏感度分别为89.5%(95%CI，66.7%-98.7%)和63.6%(95%CI，30.8%-89.1%)，而 非 癌 症 患 者的敏 感 度分 别 为89.5%(95%CI，66.7%-98.7%)和63.6%(95%CI，30.8%-89.1%[11])。在54项 研 究 的回顾中，发现该方法的敏感度为61%-82%之间，特异度为81%-93%。

2.5 流式细胞术

新的真菌检测方法可以通过促进对确诊的IFIs患者的监测来帮助指导适当的抗真菌药物的使用。例如，隐球菌性脑膜炎患者的脑脊液真菌负荷是死亡率的重要决定因素，可用于指导治疗。从历史上看，量化培养一直被用来进行这种评估。流式细胞术测量的隐球菌计数与定量培养和CrAg滴度有很强的相关性，表明这项技术可以用来快速和准确地测量HIV相关隐球菌性脑膜炎患者的真菌负荷[12]。

3 小结

尽管侵袭性真菌感染的非培养诊断方法前景较好，但目前还没有任何检测方法能降低死亡率和发病率,以及缩短住院时间，或抑制抗真菌耐药性的出现[13]。临床中应充分了解每种实验室检测方法的优缺点及检测性能，可以更好地帮助诊断侵袭性真菌感染。将传染的检测方法与抗原检测方法、PCR技术、新的检测方法联合应用可显著提高侵袭性真菌感染的检测灵敏度，从而改善患者的预后。