丘脑脑源性神经生长因子-酪氨酸激酶受体B信号介导脑缺血诱发的痛觉过敏

金博文 李东娜 庄朋伟 郭虹 张艳军

1天津中医药大学（天津 301617）；2天津中医药大学第一附属医院（天津 300193）

脑卒中后中枢性疼痛（central post-stroke pain，CPSP）是继发于脑卒中之后的慢性中枢性神经病理性疼痛，其临床症状主要为卒中后自发性疼痛、痛觉过敏、痛觉超敏和感觉异常［1］，是导致患者脑卒中后焦虑抑郁的主要原因之一，严重影响了患者卒中后恢复期的生存质量［2］。随着脑卒中发病率和存活率的逐年上升［3］，CPSP患者数量逐渐增加，目前关于CPSP发病机制的研究主要集中在神经炎症、中枢敏化和去抑制三个方面［4］，尽管近年来取得了一定进展，但CPSP的发病机制仍不完全明确，对临床有效药物的研发带来了一定困难。

脑源性神经生长因子（brain-derived neurotrophic bactor，BDNF）是中枢神经系统中广泛存在的一种基础神经营养蛋白［5］。BDNF与其受体酪氨酸激酶受体B（tyrosine kinase receptor B，TrkB）结合后，自身产生磷酸化，经过磷酸化的TrkB可激活下游多种信号传导途径而发挥生物学功能［6］，研究表明，慢性疼痛过程中BDNF-TrkB通路的异常激活与痛觉过敏有着密切联系［7］，是疼痛传导过程中的关键调节因子，但关于BDNF在脑卒后中枢性疼痛的发病过程中起到的作用，目前尚无研究。本研究拟基于丘脑BDNF信号揭示脑卒中后中枢性疼痛的发病机制，为脑卒中后中枢性疼痛的防治提供一定线索。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器 大鼠MCAO线栓（2838A5），北京西浓科技有限公司；小动物麻醉机，美国Matrx公司；石蜡包埋机，转轮切片机，德国Leica公司；倒置荧光显微镜，日本Olympus公司；电泳槽，美国伯乐公司；凝胶成像仪，和信伟业科技有限公司。

1.1.2 实验动物 SPF级8周龄雄性wistar大鼠60只，体质量270～300 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物合格证号SCXK（京）2019-0008。饲养于天津中医药大学动物中心。

1.1.3 试剂 Neun抗体（ab177487），驴抗山羊IgG H&L（Alexa Fluor®488）（ab150129），驴抗兔 IgG H&L（Alexa Fluor®647），英国Abcam公司；Iba1抗体（NB100-1028），Novus Biologicals；BDNF抗体（PB9075），TrkB抗体（BM4759），武汉博士德生物工程有限公司；β-actin抗体（GB15001），武汉赛维尔生物科技有限公司；GABAA Rα（sc-376282），圣克鲁斯生物技术；HRP标记的山羊抗兔IgG H&L（A0208），上海碧云天生物技术有限公司；2，3，5氯化三苯基四氮唑TTC（T8170），尼氏染色试剂盒（G1432），北京索莱宝科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组和造模 脑卒中后中枢性疼痛动物模型的造模方法参考HYAKKOKU等［8］的造模方法并在此基础上加以改进。大鼠随机分为假手术组（SHAM组）10只，脑卒中模型组（CPSP组）50只。术前1 d运用热板法测定大鼠热痛阈值，作为基础痛阈值。采用大脑中动脉阻塞线栓法（MCAO）建立局灶性脑缺血再灌注大鼠模型，沿右侧颈内动脉插入线栓并向前推进，直至大脑中动脉起始部被阻断，60 min后缓慢拔除线栓，恢复供血，造成脑卒中模型，假手术组仅分离颈总动脉。造模后两小时参照Zea Longa评分法评估模型［9］，评分为1～3分的大鼠视为脑卒中造模成功，术后3 d再次测定热痛阈，以术前1 d测量值为参考值，筛选出热痛阈下降超过50%的大鼠［10］，纳入模型组（CPSP）。

1.2.2 大鼠热痛阈测定 利用热板法测定各组大鼠术前1 d、术后3、7、14、21、28 d热痛阈值，将大鼠置于50℃的热板仪上，以30 s为上限值，以舔后足或连续缩足为观察指标，测试完毕，将大鼠放回笼中，间隔至少15 min后重复测试，测定3次，取后两次平均值为热痛阈值［11］。

1.2.3 脑组织TTC染色、HE染色和尼氏染色 术后3 d，从模型组和假手术组随机选取1只大鼠处死，取其脑组织，-40℃冰箱冰冻10 min，弃去脑干，每2 mm切一片，切成均匀的6～7片，室温避光用2%的TTC染液，室温避光处理30 min，后用4%多聚甲醛固定24 h，拍照采集图像［12］。术后28 d处死大鼠取其脑组织，4%多聚甲醛固定，经脱水后石蜡包埋切成5 μm薄片，固定于载玻片上，烘烤后，二甲苯脱蜡透明，梯度酒精水化，部分切片进行HE染色［13］，苏木素染色5 min，盐酸酒精分化，氨水返蓝，伊红染色1 min，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，镜下观察；另一部分切片进行尼氏染色［14］，60℃尼氏染液染色30 min，95%酒精脱色，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，镜下观察，对丘脑VPL区尼氏体进行计数。

1.2.4 Neun免疫组化检测和IBA1、BDNF免疫荧光检测 术后28 d处死大鼠取其脑组织，4%多聚甲醛固定，经脱水后石蜡包埋切成5 μm薄片，固定于载玻片上，烘烤后，二甲苯脱蜡透明，梯度酒精水化，部分切片进行Neun免疫组化检测，柠檬酸钠热修复，灭活内源过氧化酶，山羊血清封闭后，滴加兔源Neun（1∶200）4℃过夜孵育，洗去一抗后，37℃孵育HRP标记的山羊抗兔二抗（1∶50）30 min，DAB避光显色，苏木素复染后脱水封片。镜下观察并采集图片，使用Image J分析平均光密度值。另一部分切片进行IBA1、BDNF免疫荧光检测柠檬酸钠热修复，TritonX-100破膜，驴血清封闭，滴加山羊源 IBA1（1∶1 000）和兔源BDNF（1∶200）4℃过夜孵育，洗去一抗后，室温孵育驴抗山羊和驴抗兔荧光二抗（1∶1 000）2 h，DAPI染核，抗荧光淬灭封片剂封片，镜下观察并采集图片。

1.2.5 Western blot检测丘脑 BDNF，TRKB 和GABAAR蛋白的表达 术后28 d处死大鼠取丘脑组织，-80℃冷藏，加入裂解液后剪碎，提取总蛋白，BCA蛋白定量，100℃5 min使蛋白变性，取一定量的蛋白样品进行凝胶电泳，电转至0.45 nm PVDF膜上后，5%脱脂牛奶封闭2 h，一抗4℃孵育过夜，恢复室温，TBST洗膜5次，辣根过氧化物酶标记二抗室温孵育2 h，TBST洗膜5次，加入ECL荧光显色。采用Image J软件进行结果分析。

1.2.6 统计学分析 采用SPSS 23.0软件进行统计学分析，研究结果计量资料采用均数±标准差表示，实验数据图形用GraphPad Prism 5.0软件进行绘制，两组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 脑卒中模型评价 TTC染色结果如图1、表1所示，正常大鼠脑组织被染成红色，梗死脑组织被染成白色，与假手术组相比，模型组丘脑VPL区可见明显白色梗死区，涉及疼痛处理的脑区在tMCAO术后3 d受到损伤，证明tMCAO模型可以损伤大鼠丘脑。造模后，CPSP组与SHAM组相比神经功能评分升高，大鼠出现神经功能损伤，脑卒中模型造模成功。

表1 脑梗死面积与神经功能评分值Tab.1 Infarction area and Neurological deficit scores ±s

表1 脑梗死面积与神经功能评分值Tab.1 Infarction area and Neurological deficit scores ±s

注：与SHAM组比较，*P＜0.05

组别SHAM组CPSP组脑梗死面积（cm2）0 5.52神经功能评分值（分）0 2.14±0.69*

图1 脑卒中造模结果Fig.1 Results of stroke modeling

2.2 MCAO术后大鼠热痛阈变化 50只大鼠进行MCAO造模后，术后死亡14只，共36只存活，大鼠热痛阈值的变化如图2、表2所示，术前各组大鼠热痛阈差异均无统计学意义（P＞0.05）。MCAO造模后，11只大鼠出现热痛阈下降的情况，发病率为30.55%，与临床发病率一致［15］，将其纳入CPSP组，测定其术后热痛阈值，结果表明术后因MCAO导致的大鼠热痛阈下降症状持续了至少28 d。

表2 MCAO术后大鼠热痛阈变化Tab.2 Development of heat pain hypersensitivity induced by MCAO ±s

表2 MCAO术后大鼠热痛阈变化Tab.2 Development of heat pain hypersensitivity induced by MCAO ±s

注：与SHAM组比较，*P＜0.05；与SHAM组比较，**P＜0.01；与SHAM组比较，***P＜0.001

组别SHAM组CPSP组术前1 d 19.88±3.45 18.88±2.6术后3 d 20.62±2.89 8.73±3.27***术后7 d 21.41±3.53 9.84±2.45***术后14 d 17.89±1.44 10.5±2.33***术后21 d 15.93±3.94 10.2±2.79*术后28 d 17.39±4.33 9.97±2.59**

图2 MCAO术后大鼠热痛阈变化Fig.2 Development of heat pain hypersensitivity induced by MCAO

2.3 丘脑HE染色、尼氏染色、Neun免疫组化染色 大鼠丘脑VPL区的病理损伤如图3、表3所示，尼氏染色结果显示，SHAM组大鼠丘脑VPL区神经元排列规则，胞体较大，呈椎体形或椭圆形，CPSP组丘脑VPL区正常神经元排列紊乱，尼氏体数量减少，染色变浅，尼氏体数量显著降低（P＜0.05）。HE染色结果显示，SHAM组脑组织均匀，神经元排列整齐、致密，胞核无固缩、变形，CPSP组脑组织损伤明显，可见组织结构排列紊乱，细胞核形态紊乱，大量神经元细胞固缩，胞核消失。Neun免疫组化染色结果显示，与SHAM组相比，CPSP组丘脑VPL区Neun阳性表达显著减少，平均光密度值显著降低（P＜0.05）。

表3 尼氏体计数和Neun免疫组化平均光密度值Tab.3 The number of Nissl bodies and average optical density value of IHC ±s

表3 尼氏体计数和Neun免疫组化平均光密度值Tab.3 The number of Nissl bodies and average optical density value of IHC ±s

注：与SHAM组比较，*P＜0.05，***P＜0.001

组别SHAM组CPSP组尼氏体计数/mm2 233.57±10.65 142.29±8.38***Neun免疫组化平均光密度值146.24±5.44 135.65±3.41*

图3 丘脑VPL区尼氏染色、HE染色和Neun免疫组化染色Fig.3 The pathological changes of rat thalamus（VPL）

2.4 丘脑BDNF、iba1免疫荧光染色结果 免疫荧光结果如表4、图4所示，丘脑VPL区存在小胶质细胞与BDNF共表达，与SHAM组相比，CPSP组丘脑VPL区iba1与BDNF阳性表达增多。表明小胶质细胞激活后分泌的BDNF可能与MCAO术后的痛觉过敏有关。

图4 丘脑BDNF、iba1免疫荧光染色结果Fig.4 Results of IBA1 and BDNF immunofluorescence measurement

表4 丘脑BDNF、iba1阳性细胞计数Tab.4 Numbers of iba1+and BDNF+cells ±s，个/mm2

表4 丘脑BDNF、iba1阳性细胞计数Tab.4 Numbers of iba1+and BDNF+cells ±s，个/mm2

注：与SHAM组比较，***P＜0.001

组别SHAM组CPSP组iba1阳性细胞数109.72±21.38 158.4±20.67***BDNF阳性细胞数308.33±23.20 433.58±16.28***

2.5 丘脑BDNF、TRKB和GABAAR蛋白表达结果 大鼠丘脑BDNF、TRKB、GABAAR蛋白表达的结果如表5、图5所示，与SHAM组相比，CPSP组大鼠BDNF、TRKB蛋白含量显著升高（P＜0.05），GABAAR蛋白含量显著降低（P＜0.05）。

表5 丘脑BDNF、TRKB和GABAAR蛋白表达结果Tab.5 Expressions of BDNF、TrkB、GABAAR ±s

表5 丘脑BDNF、TRKB和GABAAR蛋白表达结果Tab.5 Expressions of BDNF、TrkB、GABAAR ±s

注：与SHAM组比较，**P＜0.01，***P＜0.001

组别SHAM组CPSP组BDNF 0.69±0.01 1.31±0.01***TrkB 0.77±0.07 1.24±0.07**GABAAR 1.13±0.09 0.71±0.07**

图5 丘脑BDNF、TRKB和GABAAR蛋白表达结果Fig.5 Expressions of BDNF、TrkB、GABAAR

3 讨论

脑卒中后中枢性疼痛是脑卒中后一种常见的并发症，发病机制尚不明确，是脑卒中并发症中研究较少的一种并发症，痛觉过敏是脑卒中后中枢性疼痛的主要症状之一［16］。HYAKKOKU 等［8］和TAKAMI等［17］证明tMCAO可以引起大鼠和小鼠的疼痛传导纤维Aδ和Aβ纤维发生变化，可能与CPSP的发病机制有关，但并未对其深入研究。本研究采用tMCAO复制大鼠脑卒中缺血再灌注模型，运用神经功能评分进行模型评价，同时使用热板法对脑卒中模型大鼠术前术后的热痛阈进行测定，观察大鼠术后热痛阈值的变化。结果表明，MCAO术后，大鼠神经功能评分升高，大鼠脑卒中模型复制成功；热板法结果显示，脑卒中模型大鼠术后有一部分出现了痛觉过敏的症状，且与临床脑卒中后中枢性疼痛的发病率相似［15］，表明通过tMCAO可以成功建立起CPSP动物模型。

丘脑是疼痛传导通路中的重要组成部分，有研究表明约有50%左右CPSP患者存在丘脑损伤［18］，尤其是丘脑腹外侧核的损伤［19］，极有可能引起脑卒中后中枢性疼痛的发生。目前绝大多数关于CPSP的研究均定位于丘脑的功能障碍上，尤其是脑卒中后中枢神经系统疼痛传导通路中兴奋与抑制的失衡，具体表现为中枢敏化和去抑制［20］。本研究首先使用了TTC染色评估tMCAO造模后大鼠术后3 d的脑梗死面积，在明确丘脑腹外侧核存在损伤后，通过尼氏染色、HE染色和Neun免疫组化染色进一步考察丘脑的损伤，结果表明与SHAM组相比，CPSP组丘脑VPL区组织损伤明显，尼氏体数量减少，Neun阳性表达降低，表明脑卒中后中枢性疼痛模型大鼠丘脑VPL区出现损伤。

脑源性神经生长因子（brain-derived neurotrophic bactor，BDNF）是中枢神经系统中一种重要的神经生长因子，研究表明，BDNF的异常表达与痛觉过敏有着密切联系［21］，在神经病理性疼痛中，脊髓和背根神经节中的BDNF表达升高，BDNF激活其受体TrkB，降低K+/Cl-突触后转运体（KCC2）的表达［22］，导致Cl-外排减少，而 GABA 的中枢抑制性功能的发挥主要依赖于激活离子型GABAA受体引起的Cl-内流，KCC2的表达降低严重影响了GABA的中枢抑制性功能［23］，最终导致细胞内氯离子含量的升高，中枢神经系统兴奋与抑制的失衡，脊髓背角神经元兴奋性升高，最终导致痛觉过敏。小胶质细胞作为中枢神经系统的固有免疫细胞，小胶质细胞的激活密切参与痛觉过敏的发展［24］，神经损伤后，受损的初级传入神经释放趋化因子、信号分子和蛋白酶激活脊髓中的小胶质细胞，小胶质细胞中的BDNF表达升高，从而增强脊髓伤害感受回路的兴奋性［25］。本研究采用了免疫荧光染色检测了丘脑VPL区丘脑小胶质细胞的激活与BDNF的表达，同时运用Western blot检测了丘脑BDNF、TrkB的蛋白表达，结果表明与SHAM组相比，CPSP组丘脑VPL区小胶质细胞的数量与BDNF表达增加，且出现小胶质细胞与BDNF共表达现象，Western blot结果显示，与SHAM组相比，丘脑BDNF、TrkB表达显著增加，表明脑卒中后中枢性疼痛模型大鼠丘脑BDNF、TrkB表达增加，且增加表达的BDNF是与小胶质细胞的激活有关。此外本研究发现与SHAM组相比，CPSP组丘脑GABAAR表达显著降低，表明丘脑内除了受到BDNF/TrkB间接导致的GABA抑制功能减弱外，GABAAR的表达量降低将直接导致GABA抑制功能降低，中枢去抑制。目前尚未有文献报道此现象，GABAAR有可能是脑卒中后中枢性疼痛发病机制中的另一个关键环节。

综上所述，本研究利用免疫荧光技术和Western blot技术对脑卒后中枢性疼痛模型大鼠丘脑的小胶质细胞，BDNF，TRKB，GABAAR含量进行了研究，结果表明脑卒后中枢性疼痛模型大鼠丘脑小胶质细胞数量增加，BDNF，TRKB蛋白表达增加，GABAAR含量减少，丘脑内疼痛传导信号兴奋与抑制平衡被打破，提示丘脑内BDNF的升高可能是脑卒中后中枢性疼痛发病过程中的关键病理环节，可能为脑卒中后中枢性疼痛提供新的治疗靶点和治疗措施。