生化鉴定在食品微生物检测中的应用

◎ 孙 娜，燕如娟

（飞鹤（甘南）乳品有限公司，黑龙江 齐齐哈尔 162100）

生化鉴定技术主要是根据不同种属的微生物其酶系统、代谢途径和代谢产物的较大差异，以及这些代谢产物的不同生化特征，从而对这些代谢产物加以生化测定进而鉴定微生物的种类。

1 生化鉴定原理方法及注意事项

1.1 革兰氏染色

1.1.1 革兰氏染色的原理

革兰氏染色是19世纪80年代由丹麦医师Gram创立，可用于鉴别革兰氏阴性菌与阳性菌，经革兰氏染色后的细菌可在镜下清楚观察到细菌的形态及结构特征，可用以细菌分类鉴定。①革兰氏阳性。革兰氏阳性菌细胞壁较厚，主要成分由肽聚糖相互交联而形成致密的网状结构。当细菌被结晶紫溶液染色后利用乙醇进行脱色时，细菌细胞壁的肽聚糖层因失水而导致孔径缩小以至关闭，使结晶紫与碘染色复合物无法脱色而被保留在胞内，呈现蓝紫色。②革兰氏阴性。革兰氏阴性菌细胞壁中肽聚糖含量低，脂类物质含量高，用乙醇进行脱色时，细胞壁中的脂类物质被乙醇溶解，增加了细胞壁的通透性，使得结晶紫与碘染色复合物易被乙醇抽出而脱色，随后被沙黄溶液复染着色，使细胞呈现红色。

1.1.2 操作方法

革兰氏染色法包括初染、媒染、脱色和复染等4个步骤。涂片后固定载玻片，加龙胆紫液染色10 s，水洗，甩干；加碘溶液染色10 s，水洗，甩干；加脱色液脱色10～20 s，水洗，甩干；加沙黄溶液复染 10 s，水洗；待干，镜检。

1.1.3 注意事项

①要确保使用的革兰氏染色试剂有效，并按照说明书进行试验。②选用活跃生长期菌种进行染色，部分衰老或死亡的革兰氏阳性细菌细胞壁会自行溶解，使细胞壁通透性增加，从而被乙醇脱色，因此沙黄复染后会有假阴性的情况出现。③要均匀涂片，否则太厚的地方脱色不均匀。此外，固定时不要烧过，以免菌体萎缩以至于变形。整体涂片不宜过厚，以免脱色不完全而造成假阳性。④媒染时间不宜过长。结晶紫与碘液作用时间过长会导致其复合物过于牢固结合在菌体细胞壁上，影响乙醇脱色效果，从而导致假阳性结果的出现。⑤掌握合适的脱色时间。洗脱是革兰氏染色的关键环节，应严格控制在10～20 s以保证洗脱效果。洗脱时间过短会导致革兰氏阴性菌体内的结晶紫复合物不能被有效洗脱出来，使阴性菌出现假阳性；而洗脱时间过长，革兰氏阳性菌的细胞壁结构可能会被乙醇破坏，导致胞内的结晶紫复合物被洗脱，出现假阴性。

1.2 糖发酵试验

糖发酵试验是肠道细菌鉴定中最常用的生化反应，其目的在于检测不同细菌利用各种碳源的能力。大多数细菌都能利用糖类作为碳源，但不同的细菌表达不同的酶系，所以在分解糖类物质的种类和能力上有很大差异[1]。实验室微生物检验项目中肠杆菌科的鉴定多用到葡萄糖发酵实验，具体操作方法为用接种针挑取典型菌落，穿刺于葡萄糖琼脂内，于（36±1）℃培养（24±2）h，若试管内的内容物变为黄色，判为阳性反应；不变色判为阴性反应。此外，用接种针挑取典型菌落，穿刺于葡萄糖琼脂内时，应注意不要触及试管底部。

1.3 吲哚试验

1.3.1 原理

吲哚试验又名靛基质试验，其原理是基于某些细菌能够分解色氨酸生成吲哚，吲哚可以与试剂中的对二甲氨基苯甲醛结合生成玫红色的玫瑰吲哚，用以检测细菌分解色氨酸的能力[2]。

1.3.2 操作方法及注意事项

按照API20E说明书使用棉签拭子从分离物的平板上挑取已分离提纯的单个菌落至安瓿瓶中，用毛细滴管反复吹打，制成均一的菌悬液，将菌液接种到小管及小杯中，利用石蜡油覆盖指定的生化孔（有划线的孔），盖上盖子进行培养，按操作说明书规定，将附加试剂加进小孔内，进行判读。用接种环挑取菌落不容易混匀，还易挑到培养基对结果产生一定的干扰，可使用专用的棉签拭子挑取菌落。

1.4 氧化酶试验

1.4.1 原理

氧化酶又称细胞色素氧化酶、细胞色素氧化酶C或呼吸酶，细胞色素呼吸酶系统的终末呼吸酶，该实验用以检测细菌中是否存在该酶。该试验原理基于细胞中氧化酶可氧化细胞色素C，而氧化型细胞色素C可氧化四甲基对苯二胺，出现紫色反应[3]。实验室可用氧化酶试验鉴定克罗诺杆菌属（阪崎肠杆菌）以及肠杆菌科等。

1.4.2 操作方法及注意事项

在平皿中放置一张普通的滤纸并滴上氧化酶试剂。用接种环挑取一单独的菌落在滤纸上涂抹少许。一张滤纸可进行多个菌落的实验。观察菌落15 s内颜色的变化，若变成紫色或深紫色，为氧化酶阳性；不变色，为氧化酶阴性；同时滴1滴氧化酶试剂在没有沾取菌落的滤纸上做阴性对照，应不变色。此外，应使用铂/铱接种环或玻璃棒（不要用镍铬接种环）挑取单个菌落。

1.5 赖氨酸脱羧酶试验

1.5.1 原理

赖氨酸脱羧酶的原理基于某些能产生赖氨酸脱羧酶的细菌可将赖氨酸脱羧生成碱性更强的胺和二氧化碳，经溴甲酚紫指示剂染色后可使培养基呈紫色[4]。

1.5.2 操作方法及注意事项

用接种环或接种针挑取单个菌落，接种赖氨酸脱羧酶试验培养基，（36±1）℃培养18～24 h，必要时可延长培养时间至48 h。实验室主要用于沙门氏菌的鉴定。在进行沙门氏菌验证时，接种三糖铁琼脂培养基时先于斜面划线，然后再底层穿刺；接种针接种时应注意不要灭菌，直接接种于赖氨酸脱羧酶培养基与营养琼脂培养基上。

1.6 尿素酶试验

1.6.1 原理

尿素酶试验的原理基于某些能够表达尿素酶的细菌可分解尿素产氨，使培养基呈碱性[5]。因此，将被检菌接种于相应的尿素培养基，于（36±1）℃培养18～24 h后观察结果，可以产生尿素酶的细菌分解尿素后培养基呈碱性，可以使酚红指示剂变红。实验室主要用尿素酶试验鉴定沙门氏菌。

1.6.2 操作方法及注意事项

用接种环或接种针挑取单个菌落，直接接种于尿素酶培养基，（36±1）℃恒温培养18～24 h后观察，必要时可延长至48 h。此外，在进行沙门氏菌验证时，接种三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基的同时，可直接接种尿素酶。

1.7 三糖铁琼脂试验

1.7.1 原理

在进行三糖铁琼脂试验时，可同时观察乳糖和蔗糖发酵产酸或产酸产气（变黄），产生硫化氢（变黑），实验室主要用三糖铁琼脂试验鉴定沙门氏菌。

1.7.2 操作方法及注意事项

在进行沙门氏菌验证时，从选择性琼脂培养基上分别挑取2个以上典型或可疑菌落，接种三糖铁琼脂培养基，先于斜面上划线，再于底层穿刺；于（36±1）℃培养18～24 h，必要时可延长至48 h。在进行沙门氏菌验证时，接种三糖铁琼脂要注意先在斜面划线，再于底层穿刺。

1.8 血清学反应

1.8.1 原理

在微生物分类鉴定中，血清学反应是指利用血清学反应的基本原理，将已知菌种或菌型的细菌免疫动物制备抗血清，然后根据待检微生物样品是否能与其发生特异性的血清学反应来鉴定未知菌种的方法。实验室主要用血清学反应鉴定沙门氏菌。

1.8.2 操作方法及注意事项

按照说明书进行试验，于载玻片上选取两块约 1 cm×2 cm的区域，用无菌接种环挑取待测菌接种于每块区域的上部，于其中一块区域的下方滴加多价菌体抗血清，另一区域下部滴加等量生理盐水为阴性对照。然后用无菌接种环分别将两区域的待测菌与抗血清（生理盐水）研磨成乳液状，并将载玻片倾斜，持续摇动混合1 min，于黑暗背景下观察凝集状态，出现任何程度的凝集现象均可判定为阳性反应。在进行血清学试验时，应注意使用接种环或针将菌苔研成乳状液时，先在生理盐水中研磨，再进行血清研磨。

1.9 过氧化氢酶试验

1.9.1 原理

过氧化氢酶试验的原理是黄酶系统的呼吸酶在电子传递链将氢传递给分子氧生成过氧化氢，而过氧化氢活细胞具有毒性，含有过氧化氢酶细菌可以催化过氧化氢使其分解为水和分子态氧。判定标准为30 s内产生大量气泡为阳性，不产生气泡为阴性。革兰氏阳性球菌中，葡萄球菌与微球菌可产生过氧化氢酶，因此该反应呈阳性，而链球菌属细菌过氧化氢酶反应呈阴性，因此该反应可用于区分葡萄球菌和链球菌，实验室多用于蜡样芽孢杆菌与金黄色葡萄球菌的鉴定。

1.9.2 操作方法

用吸管吸1滴3%过氧化氢溶液在载玻片上。用无菌的塑料接种环或木制无菌牙签挑取一单独菌落与过氧化氢溶液混合。如果有气泡产生，判定为过氧化酶阳性；没有气泡产生，判定为过氧化酶阴性。一般微球菌属和芽孢杆菌属为阳性结果，乳酸杆菌属和链球菌属为阴性结果。

1.9.3 注意事项

①自配的3% H2O2溶液，不能倒入长有菌落的血琼脂平板上，可能会产生假阳性结果。②不能用铂金类或镍合金类的接种针或接种环去混合培养物和3% H2O2溶液，可能会产生假阳性。③菌落较小时可能出现假阴性的结论。

1.10 蛋白质毒素结晶试验

1.10.1 操作方法

挑取纯培养的独立可疑菌落接种于硫酸锰营养琼脂平板上，经（30±1）℃培养（24±2）h，并将平板置于室温放置3～4 d，挑取少量培养物于载玻片上，加入蒸馏水混匀。自然干燥然后微火固定，加甲醇作用30 s后弃去，然后通过火焰进行干燥，再于载玻片上滴满0.5%碱性复红，再次放火焰上加热，1～2 min 后移去火焰，再更换染色液染色30 s，倾去染色液用蒸馏水彻底清洗、晾干后镜检。实验室可用于鉴别蜡样芽孢杆菌与苏云金芽孢杆菌。

1.10.2 注意事项

①菌液浓度过高，可能会导致非典型的结论。②在载玻片上滴满0.5%碱性复红时，在火焰上加热需要微见蒸气，注意不要使染液沸腾。③如发现游离芽孢的形成不丰富，应将培养物置室温2～3 d再进行检查。

1.11 动力试验

动力试验是有动力的细菌会延穿刺路线扩散生长，实验室主要用于蜡样芽孢杆菌和单核细胞增生李斯特氏菌的鉴定。具体操作方法为用接种针挑取培养物穿刺接种于动力培养基中，30 ℃培养24 h。有动力的蜡样芽孢杆菌应沿穿刺线呈扩散生长。此外，用接种针挑取典型菌落进行穿刺时，注意不要触及试管 底部。

1.12 溶血试验

1.12.1 原理

溶血试验的原理基于某些细菌在代谢过程中可以产生能够使人或动物的红细胞裂解的溶血素，因此将待检细菌划线接种于绵羊血平板后，可在菌落周围观察到明显溶血圈。当待检菌落周围出现透明的溶血圈时，待测菌为完全溶血（β溶血）；当待检菌落周围出现绿色溶血圈，待测菌为不完全溶血（α溶血）；当待检菌落周围无溶血环则为不溶血（γ溶血）。实验室主要用于金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌以及单核细胞增生李斯特氏菌的鉴定。

1.12.2 操作方法及注意事项

挑取纯培养的单个疑似菌落，接种至胰酪胨大豆羊血琼脂培养基上，（30±1）℃培养（24±2）h。典型菌落为浅灰色，且不透明，似白色毛玻璃状，有完全溶血环或草绿色溶血环。用接种针挑取典型菌落时，注意不要触及平皿底部。

1.13 血浆凝固酶试验

1.13.1 原理

血浆凝固酶试验的原理基于某些细菌产生的血浆凝固酶可以使血浆中的纤维蛋白原变为纤维蛋白。细菌分泌的凝固酶大致分为两类。①一种凝固酶可直接结合于细菌的细胞壁，当血浆中的纤维蛋白直接接触时可将细菌凝集成颗粒状，针对产生该种凝固酶的细菌多用玻片法进行鉴定。②凝固酶也称游离血浆凝固酶，指细菌将凝固酶分泌至胞外，在接触血浆后将血浆中的纤维蛋白原凝集为纤维蛋白，多用试管法进行检验。判定标准为检测6 h内，待检管和阳性对照管出现凝集，阴性对照管不凝集，凝固酶检测为阳性。实验室主要用于金黄色葡萄球菌鉴定，一般凝固酶呈阴性的葡萄球菌多为非致病性，而凝固酶呈阳性的葡萄球菌多为致病性葡萄球菌。

1.13.2 操作方法

打开冻干血浆，每支西林瓶中加入0.5 mL无菌生理盐水完全溶解，加BHI培养基中的培养物0.2～0.3 mL， 并充分振荡摇匀，放置于（36±1）℃培养箱内，每间隔30 min观察一次，观察至6 h，如呈现凝固或凝固体积大于原体积的一半，可判定阳性结果。

1.13.3 注意事项

在进行血浆凝固酶试验时，要同时以血浆凝固酶试验阳性菌株和阴性葡萄球菌菌株的肉汤培养物作为对照试验。

2 结语

生化鉴定技术有显著的特异性，上述实验在实验室的生化鉴定过程中不断地实践与总结经验，随着科学技术的发展，越来越多的生化鉴定技术应用到微生物鉴定中，给微生物检测带来新的机遇和发展。