美拉德反应调控大豆蛋白功能性质的研究进展

◎ 薛 远，宋春丽，任 健

（齐齐哈尔大学 食品与生物工程学院，黑龙江 齐齐哈尔 161006）

食品蛋白质的糖基化修饰，是将亲水性的糖类物质以共价键连接的方式连接到蛋白质分子之中，使其既具有蛋白质的大分子特性，又具有糖类物质的亲水特性[1]。美拉德反应是在食品领域中对蛋白质进行改性时常用的技术手段。美拉德反应是蛋白质的游离氨基与还原糖的羰基共价交联，产生糖基化蛋白质的过程[2]。本文对美拉德反应对大豆蛋白结构、功能性质的影响以及目前美拉德产物构效关系研究存在的局限性进行综述，同时展望了该研究在食品加工中的应用前景。

1 美拉德反应机理

美拉德反应是食品加工中普遍存在的、涉及碳水化合物和蛋白质的一类非褐变反应，最初是由法国化学家Louis-Camille Maillard发现。该反应是蛋白质、肽或氨基酸的氨基与还原糖的羰基发生了缩合、降解、裂解等反应，席夫碱形成并重排为Amadori或Heyns产物，最后形成了大分子化合物类黑素，导致褐变[3]。糖基化反应过程主要由3个阶段（早期、中期、晚期）构成，采用糖分子对蛋白质进行改性主要是基于美拉德反应早期的第一步，即还原糖的羰基和蛋白质的氨基发生共价交联反应，生成糖基化蛋白质。美拉德反应产物的产量与种类主要受反应温度、反应时间、pH以及氨基与糖基比等条件的影响，导致产物的理化性质、结构和功能性不同。

目前，美拉德反应分为干热法和湿热法。干热法是最早制备蛋白质糖基化产物的方法之一，且具有无额外反应底物、易控制反应条件和高接枝度的优点。干热法是先将蛋白质与糖分子混合溶液冻干，针对固体反应底物，在一定相对湿度和反应时间下进行高温加热，制备糖基化蛋白质。利用大豆蛋白与麦芽糊精作为底物，在90 ℃下进行干热糖基化反应，制备大豆蛋白-麦芽糊精共聚物，结果表明干法美拉德反应能够提高大豆蛋白的溶解性和乳化性等相关性质[4]。

湿热法是最基础的糖基化加工方法，湿热法是蛋白质与糖分子的混合溶液在高温下发生糖基化反应，冻干得到糖基化产物。湿热法美拉德有利于蛋白质和糖分子之间的接触发生反应，提高该反应的接枝度，从而对蛋白质的功能性质产生影响。利用大豆蛋白与杏鲍菇多糖在90 ℃条件下反应1 h，进行湿热法美拉德反应，制备大豆蛋白-杏鲍菇多糖共聚物，结果表明糖基化后的大豆蛋白具有更好的溶解性和乳化性，能够制备高稳定性的大豆蛋白-杏鲍菇多糖共聚物稳定乳剂[5]。

2 美拉德反应对大豆蛋白结构的影响

美拉德反应使大豆蛋白与还原糖发生共价交联，能够改变大豆蛋白的结构，进而对蛋白质的功能性质产生影响。

2.1 微观结构

目前，测定蛋白质微观结构的方法主要有扫描电子显 微 镜（Scanning Electron Microscope，SEM）、透射电子显微镜（Transmission Electron Microscope，TEM）和激光共聚焦扫描显微镜（Confocal Laser Scanning Microscope，CLSM）。以大豆蛋白与麦芽糖为原料，进行美拉德糖基化反应制备糖基化产物，利用SEM检测证实，糖基化产物的颗粒与大豆蛋白相比更加疏松、均匀且分子聚集性显著降低[6]。采用大豆蛋白与大豆多糖制备多糖蛋白复合性乳液，利用TEM，发现复合乳液的乳液液滴分布均匀、颗粒大小均一，结果证明多糖增加了大豆蛋白的乳液稳定性[7]。利用CLSM分析乳状液的微观结构，证明大豆肽-葡聚糖共聚物可以在油滴表面形成一个很厚的吸附层，提高油滴的抗破乳能力，增加乳液的稳定性[8-10]。

2.2 一级结构

傅里叶红外光谱（Fourier Transform Infrared Spectoscopy，FT-IR）能够反应糖基化蛋白一级结构的变化，主要体现在C-N和N-H键吸收峰弯曲振动。FT-IR研究发现，大豆蛋白-果糖共聚物在1 600～1 500 cm-1处的酰胺I特征峰和在1 500～1 400 cm-1酰胺Ⅱ特征峰波动减弱[12]；大豆蛋白-葡聚糖共聚物在1 410 cm-1区域的酰胺Ⅲ特征峰振动增强，相应的，C-O伸展和O-H弯曲也发生了变化，即在2 931 cm-1和3 290 cm-1处发生了C-H伸缩振动与N-H的伸缩振动，证实美拉德反应对大豆蛋白一级结构产生影响[13]。

2.3 二级结构

糖基化导致食品蛋白质的二级结构发生改变，主要形式包括α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲数量的变化，这决定了蛋白质的构象和功能。二级结构可以通过圆二色谱（Circular Dichroism，CD）和FT-IR来检测。利用CD分析证实，大豆蛋白-麦芽糖共聚物与大豆蛋白相比，α-螺旋、β-折叠和β-转角含量降低，无规则卷曲含量显著增加，美拉德反应对大豆蛋白的二级结构有显著影响[11]。采用葡萄糖、乳糖与11S大豆球蛋白分别进行美拉德反应后，利用FT-IR检测发现11S大豆球蛋白-葡萄糖共聚物和11S大豆球蛋白-乳糖共聚物的α-螺旋、β-折叠、β-转角的含量都显著减小，但无规则卷曲的含量显著增加，证实美拉德反应对11S大豆球蛋白二级结构影响显著[12]。

2.4 三级结构

一般来说，利用荧光光谱分析色氨酸光谱，能够观察蛋白质三级结构的变化情况。利用内源荧光光谱发现，大豆蛋白-果糖共聚物的荧光强度降低，最大激发波长（λmax）增加，证实美拉德反应改变了大豆蛋白的三级结构[13]。利用外源荧光光谱进行分析，大豆蛋白水解物-葡聚糖共聚物的最大荧光强度发生了红移现象，色氨酸的周围环境极性增强，且荧光强度降低，这一结果证实美拉德反应使葡聚糖取代大豆蛋白表面的分子，对大豆蛋白的三级结构产生显著影响[14]。

3 美拉德糖基化产物功能性质的变化

3.1 溶解性

溶解性是指大豆蛋白在水溶液中的溶解能力。大豆蛋白的溶解性在食品加工中起到了重要作用，美拉德反应使大豆蛋白的亲水性羟基增多，改善蛋白质的溶解性，从而扩大大豆蛋白的应用范围。干热法制备的大豆蛋白-葡萄糖共聚物的溶解性显著高于大豆蛋白，而且也显著高于超声法改性大豆蛋白，表明美拉德反应比超声法更有利于提高大豆蛋白的 溶解性[15]。

反应时间会影响大豆蛋白的溶解性。美拉德反应初期，大豆蛋白中引入大量亲水性糖分子，亲水性羟基含量增加，溶解性增高。然而，反应时间过长，会有一部分蛋白质因分子量增大发生聚集沉降，导致溶解度下降。同时，美拉德反应时间过长，会进入到晚期阶段，生成类黑素等大分子物质，最终蛋白质的溶解性降低。在90 ℃水浴条件下，将大豆蛋白与乳糖按质量比4∶1进行美拉德反应实验，加热时间分别为1～5 h，制备得到大豆蛋白-乳糖共聚物。结果证实，随反应时间增加，大豆蛋白的溶解性逐渐增强，当反应达到3 h后，随着反应时间的增加，溶解性逐 渐下降[16]。

糖的种类也会影响大豆蛋白的溶解性。在80 ℃条件下，按1∶4的质量比分别将葡萄糖、麦芽糖与大豆蛋白相混合，制备糖基化产物，发现随反应时间增加两种糖基化大豆蛋白的溶解性逐渐升高，且高于大豆蛋白。此外，大豆蛋白-麦芽糖共聚物的溶解性总是高于大豆蛋白-葡萄糖共聚物。反应时间高于6 h后，两种产物的溶解性下降，其中大豆蛋白-葡萄糖共聚物的溶解性要低于大豆蛋白。葡萄糖分子较小，与麦芽糖相比更容易与大豆蛋白发生反应，产生类黑素等，反应时间过长会降低大豆蛋白的溶解性[17]。

3.2 乳化性质

乳化性是大豆蛋白乳浊液形成能力与稳定性的重要影响因素，而大豆蛋白的乳化性是由其本身的结构与溶解性决定的。美拉德反应可以使大豆蛋白的亲水性增强，更有利于有效吸附在油-水界面上，通过降低表面张力来提高蛋白质的乳化性及乳化稳定性。通过改变大豆蛋白与阿拉伯胶的原料质量比、反应时间制备出乳化性显著提高的大豆蛋白。研究证实在质量比1∶2（阿拉伯胶∶大豆蛋白）、反应温度60 ℃条件下反应16 h，大豆蛋白的乳化性显著提高51.2 m2·g-1[14]。

美拉德反应时间增加会改变大豆蛋白的结构，对乳化性及乳化稳定性产生影响。美拉德反应初期，蛋白质的游离氨基逐渐暴露在蛋白质分子表面，随反应时间增加生成更多的糖基化产物，亲水性羟基增加，达到亲水和亲油的平衡，乳化性增强；美拉德反应时间过长，反应体系中游离氨基和壳寡糖的羰基逐渐减少，蛋白质发生自交联，溶解性逐渐下降，乳化性降低。此外，糖基化产物增加，会使吸附在油-水界面处油滴上的保护层厚度有所增大，油滴不易发生聚集现象，乳化稳定性增强。以葡萄糖和大豆蛋白原料，在质量比4∶1、反应温度70～90 ℃条件下反应0～6 h， 得到反应时间和温度不同的大豆蛋白-葡萄糖共聚物。结果证实，随反应时间增加，反应体系的颜色不断加深，且乳化性及乳化稳定性显著提高；在反应 6 h时，大豆蛋白乳化性提高最为显著，从0.168提高到了0.574。在反应4 h时，乳化稳定性提高最为显著，从17.37%提高到38.7%[18]。在不同反应时间、反应温度条件下制备大豆蛋白-壳寡糖共聚物，以乳化性为响应面，探究制备高乳化性的大豆蛋白-壳寡糖共聚物的最佳反应条件。结果发现，大豆蛋白-壳寡糖共聚物的乳化性以及乳化稳定性随反应时间的增加出现先升高再降低的趋势，且在反应时间为9 h时达到最高值[19]。

美拉德反应温度也会对乳化性及乳化稳定性产生影响。控制美拉德反应温度可以使蛋白质结构得到伸展，提高蛋白质的分子表面活性，减少空间位阻，有利于蛋白质与糖分子发生反应，生成大量糖基化产物，提高大豆蛋白的乳化性及乳化稳定性。但是温度过高时，蛋白质会发生变性，分子的表面活性降低，阻碍两者的结合，从而减少糖基化产物产生，使乳化性及乳化稳定性下降。以大豆蛋白和壳寡糖为原料，采用不同温度条件下反应9 h制备大豆蛋白-壳寡糖共聚物。结果证实，反应温度对乳化性和乳化稳定性产生影响不同，在40 ℃时大豆蛋白-壳寡糖共聚物的乳化性以及乳化稳定性达到最大值[19]。

3.3 流变性

流变性测定包括蛋白质的表观黏度以及黏弹性能。食品蛋白质的黏弹性不同，会赋予食品不同的质感。在超声和未超声条件下制备大豆蛋白-香菇多糖共聚物，证实大豆蛋白-香菇多糖共聚物在未超声条件下，表观黏度显著提高（13.89%），超声40 min后表观黏度（26.48%）是传统方式1.91倍。美拉德反应能够提高大豆蛋白的表观黏度，且与超声法结合后大豆蛋白的表观黏度改善更加明显[20]。将大豆蛋白与葡萄糖按质量比1∶2混合，在95 ℃条件下反应4 h，得到大豆蛋白-葡萄糖共聚物，通过转谷氨酰胺酶法制备凝胶，对凝胶模拟体外胃肠道消化实验，证实消化产物的黏度、弹性模量（G′）、黏性模量（G″）显著升高[21]。

4 大豆蛋白及其糖基化产物在食品加工中的应用

大豆蛋白因为其良好的营养品质及多种功能特性而被广泛应用于肉制品、焙烤食品、饮料、乳品、食品涂层和糖果等食品工业领域。

4.1 在肉制品中的应用

大豆蛋白及其糖基化产物在肉制品中能够改善肉制品的风味、阻止肉汁分离和提高肉类制品的品质等。在猪肉制品中加入大豆蛋白后，不仅能提高肉制品的硬度，增强了咀嚼口感，而且还能弥补肉制品高热量、高胆固醇等缺点[22]。将大豆蛋白糖基化产物与肌原纤维蛋白混合制成凝胶，证实添加大豆蛋白的肌原纤维凝胶比原肌原纤维蛋白凝胶微观结构更加致密均匀，且提升了肌原蛋白凝胶的弹性和硬度[23]。

4.2 在烘焙制品中的应用

大豆蛋白及其糖基化产物在烘焙制品中能够改善食品的色泽，提升口感和风味，还可以保持游离水，有效延长产品的货架期。通过美拉德反应制备大豆蛋白-低聚木糖共聚物，证实该共聚物添加在重油蛋糕中，能有效延长重油蛋糕的货架期，提高重油蛋糕的适口性以及耐储藏特性[24]。在面包的制作过程中加入糖基化大豆蛋白，面包的硬度降低，而且面包的弹性和回复性提高[25]。

4.3 在冰淇淋中的应用

冰淇淋是受到人们喜欢的一种乳制品，但是有一部分人患有乳糖不耐症，将大豆蛋白添加在冰淇淋中可以降低其乳糖含量，使消费者有效避免乳糖不耐症的不良反应。以大豆蛋白和乳粉为原料，按一定比例制作冰淇淋，发现添加大豆蛋白使冰淇淋的融化率、黏度与硬度显著提高，且无不好的豆腥味，感官评价的综合指标增加，适合应用于冰淇淋生产[26]。将大豆蛋白和乳清蛋白按比例进行配比制备出复配蛋白质，分析发现复配蛋白冰淇淋的硬度较好、抗融化性以及膨胀率增强[27]。

5 糖基化产物构效关系研究存在的局限性

研究证实美拉德反应的糖基化可以改善大豆蛋白的许多重要功能性质，在食品领域具有一定发展潜力。目前，基于美拉德途径的蛋白质糖基化修饰，通常采用两种方式调控蛋白质的糖基导入量：一种手段是控制糖基化反应时间，但该法存在一定的局限性，如存在反应过度产生类黑素等有害物质的情况，而且将破坏蛋白质的功能性质；另一种方式是通过改变导入糖基的分子量，如分别将单糖、寡糖、多糖导入到蛋白质中，获得具有不同糖基导入量的蛋白质。值得注意的是，美拉德反应在导入糖基的同时，还伴随着蛋白质的自交联现象。因此，上述方法在剖析糖基导入量对美拉德产物功能性质的影响规律时，很难界定蛋白质自交联带来的潜在影响，所得结论缺乏严谨性、科学性。

6 展望

阐明美拉德反应中糖基变化对蛋白质构效关系的影响机制，对开发特定功能性食品配料具有重要意义。但是，目前美拉德糖基化研究在该方面具有一定局限性，急需在保证大豆蛋白自交联程度不变的前提下，基于定向改变糖基化大豆蛋白侧链糖基的方法，开展揭示美拉德途径糖基化蛋白质构效关系的相关研究，通过各个指标的分析和评估研究，确定、剖析大豆蛋白糖基化产物结构和功能性质的影响模式和机制，为定向开发特定功能的大豆蛋白配料提供理论支撑，有利于扩大大豆蛋白在食品加工领域中的应用范围。