PCSK9在肿瘤发生中的作用及其在免疫治疗中的潜在价值*

张欣 汪越 魏嘉

作者单位：南京大学医学院附属鼓楼医院肿瘤中心(南京市210008)

前蛋白转化酶枯草杆菌素Kexin9型（proprotein convertase subtilisin/kexin type 9，PCSK9）属于前蛋白转化酶（proprotein convertases，PCs）家族。PCs家族是一类内切蛋白酶，主要功能是切割加工前体蛋白使其获得生物活性。PCs家族共包含九个成员，其中PCSK9是最新发现的成员[1]。近年来PCSK9在肿瘤中的作用受到广泛的关注，大量的临床前研究得以开展，包括肝癌[2]、肺癌[3]、乳腺癌[4]等。PCSK9在不同的癌种中通过调节肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭、转移、放疗耐受性等扮演着促进肿瘤的角色。在肿瘤免疫治疗领域，PCSK9在调节肿瘤浸润免疫细胞方面也起到重要作用，联合使用PCSK9抑制剂或单克隆抗体在肿瘤动物模型的免疫治疗中表现出显著的疗效。随着研究的深入，PCSK9单克隆抗体也被投入抗肿瘤相关临床试验，目前仍处于初级探索阶段。本文将对PCSK9在肿瘤发生中的作用和机制以及PCSK9在肿瘤免疫治疗的潜在价值进行阐述，以期为进一步探索PCSK9在抗肿瘤治疗中的应用提供理论依据。

1 PCSK9概述

PCSK9于2003年首次被报道[1]，该基因位于1p32上，含12个外显子，成熟的PCSK9蛋白是一种非活性可溶性酶原，由前结构域、信号肽、催化结构域和C端结构域组成，主要由肝脏合成分泌，也合成分泌于小肠、肾脏、脑等器官中[5]。最初因其在神经系统的发育中起重要作用，被命名为神经细胞凋亡调节转化酶-1（neural apoptosis-regulated convertase-l，NARC-1）[6-7]，随着研究的深入，发现PCSK9可与细胞膜上低密度脂蛋白受体（low-density lipoprotein receptor，LDLR）结合，介导LDLR降解，从而使细胞摄取胆固醇能力下降，血浆中低密度脂蛋白（low-density lipoprotein，LDL）水平升高，导致高脂血症[8-10]。有研究表明，PCSK9基因的两种功能获得型突变（S127R和F216L）增加了LDLR的降解，减少了循环中LDL的清除，与家族性高胆固醇血症有关[1，11]。近年来，随着对PCSK9研究的深入，其与肿瘤发生发展的相关性日益突显，PCSK9可通过调节肿瘤细胞内质网应激、线粒体死亡等多条途径促进肿瘤的发生发展，此外，PCSK9还可调节肿瘤免疫微环境导致免疫逃逸，靶向PCSK9在抗肿瘤治疗中表现出良好的潜力。

2 PCSK9在肿瘤中的作用及相应机制

2.1 PCSK9抑制肿瘤细胞凋亡介导肿瘤发生与进展

抵抗细胞死亡是正常组织向肿瘤转化的重要特征，肿瘤细胞能通过抑制凋亡因子、抑制凋亡通路的激活等方式抵抗细胞凋亡。PCSK9抑制凋亡因子以肿瘤细胞的凋亡进而介导肿瘤发生与进展，Zhang等[2]研究发现，PCSK9可通过抑制凋亡相关因子抑制肝癌细胞凋亡，这种抑制凋亡作用由下游的脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，FASN）介导B淋巴细胞瘤-2（Bcell lymphoma-2，Bcl-2）上调、以及Bcl-2相关X蛋白（BCL2-associated X protein，Bax）、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶9（cysteinyl aspartate specific proteinase 9，Caspase9）和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（cysteinyl aspartate specific proteinase 3，Caspase3）下调等实现。研究发现PCSK9-siRNA还可以通过调节凋亡相关因子XIAP、survivin蛋白水平以及线粒体凋亡、内质网应激等通路以促进肺腺癌细胞A549、神经胶质瘤细胞U251和神经内分泌瘤细胞BON-1的凋亡[12-14]。此外，PCSK9 可通过多条途径抑制凋亡通路的激活介导肿瘤进展。Jacome[15]研究发现，PCSK9在卵巢癌中表达水平较癌旁组织高，并且PCSK9过表达能稳定磷酸化AKT，同时细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）1/2表达增加，促进卵巢癌细胞的存活，而siRNA介导的PCSK9下调能抑制其存活，PCSK9小分子抑制剂PF-06446846也起到相同的抑制作用。有研究发现，在胃癌中PCSK9通过上调热休克蛋白70（heat shock protein 70，HSP70）的表达，激活丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）通路调节细胞凋亡，shRNA介导的PCSK9下调能抑制这种作用[16]。此外，在肿瘤转移动物模型中也发现同样的作用，Sun等[17]研究发现，敲除PCSK9能够激活肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）通路促进小鼠黑色素瘤肝转移模型中的肿瘤细胞凋亡。以上研究表明PCSK9能够通过调节细胞凋亡相关因子、线粒体凋亡、内质网应激等多条途径调节不同癌种肿瘤细胞的增殖和凋亡，从而介导肿瘤的发生与进展，而这种作用可以通过抑制PCSK9逆转。

2.2 PCSK9促进肿瘤细胞侵袭和转移

侵袭和转移是大多数肿瘤晚期患者的主要死亡原因，PCSK9与肿瘤的侵袭和转移具有显著性相关。有研究将黑色素瘤细胞B16-F1注射到野生型和PCSK9敲除小鼠体内诱导肝脏转移模型，发现野生型小鼠肝转移率是PCSK9敲除小鼠肝转移率的2倍，这种差异由PCSK9敲除后胆固醇水平降低以及TNF-α介导的细胞凋亡增加介导[17]。在Suh等[18]研究中将黑色素瘤细胞B16F10注射到Ahnak基因敲除小鼠体内，使用转化生长因子-β（transforming growth factorβ，TGF-β）诱导肺转移，转录组学分析发现PCSK9和其他候选基因参与了黑色素瘤细胞侵入肺组织的过程，而条件性敲除PCSK9基因后转移受到明显抑制，进一步的研究发现其与TGF-β诱导的上皮-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）相关。此外，在胰腺神经内分泌瘤细胞BON-1中，PCSK9是microRNA-224的靶基因，当使用MicroRNA-224agomir或PCSK9-siRNA转染时，表现出抑制细胞侵袭的作用[13]。PCSK9在胃癌中也表现出同样的功能，Xu等[16]检测了7种人源性胃癌细胞系（SGC-7901、MKN-45、MKN-28、KATO-III、AGS、MGC-803、NCI-N87）中PCSK9的表达水平，选择表达水平最低的MGC-803细胞和表达水平最高的SGC-7901分别建立了PCSK9高表达和PCSK9低表达的胃癌细胞系，发现PCSK9高表达促进了胃癌细胞的侵袭和转移，其作用机制与HSP70的上调和MAPK信号通路的激活相关。这些研究均说明了PCSK9高表达可通过调节细胞因子、生长因子、EMT及相关信号通路的激活促进肿瘤细胞侵袭和转移，介导肿瘤进展。

2.3 PCSK9对肿瘤细胞的其他作用及机制

除了发现PCSK9能调节肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭及转移以外，Gan等[19]研究发现，抑制PCSK9的表达能够提高前列腺癌的放疗耐受性，其作用机制与抑制Bax/Bcl-2、caspase-3、细胞色素C、基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）水平相关，该研究使用高剂量放疗（8 Gy）处理前列腺癌细胞后，发现PCSK9-siRNA预处理提高了细胞活性，减少了细胞凋亡，表明对肿瘤患者进行放疗时保持一定的PCSK9水平可以提高前列腺癌患者放疗敏感性，提示PCSK9高水平可能是放疗敏感的标志。

3 PCSK9的免疫调节作用及在肿瘤免疫治疗中的潜在价值

免疫细胞是肿瘤微环境的重要组成部分，包括抗肿瘤免疫细胞以及促肿瘤免疫细胞。其中T细胞是主要的抗肿瘤免疫细胞。PCSK9在肿瘤中促进肿瘤发生免疫逃逸，其机制与调节T细胞的浸润与功能相关，靶向PCSK9治疗可以逆转这一现象。此外，PCSK9对肿瘤免疫微环境有潜在的调控作用，包括M2型巨噬细胞的迁移和极化以及影响肿瘤血管生成等。PCSK9在非肿瘤疾病中对DC和巨噬细胞也表现出一定的调控潜力。目前，靶向PCSK9的抑制剂、单克隆抗体和疫苗在肿瘤动物模型中取得了良好的疗效，相关临床试验也正在开展。

3.1 PCSK9对T细胞的调节作用

PCSK9在调节T细胞的浸润以及功能方面发挥重要的作用。Liu等[20]研究发现，敲除PCSK9基因后肿瘤细胞成瘤能力明显减弱，小鼠生存期延长，重新导入PCSK9后致瘤能力恢复，生存期缩短，而这种变化在缺乏T、B和NK细胞的NCG小鼠中未发现，随后流式检测发现PCSK9敲除介导瘤内CD8+、CD4+、γδT以及NK细胞的浸润显著增加以及细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocytes，CTLs）与调节性T细胞（regulatory T cells，Tregs）的比率、干扰素-γ（interferon-γ，IFN-γ）阳性或颗粒酶B（granzyme B，GZMB）阳性CTLs的数量显著增加，进一步的研究发现PSCK9可结合肿瘤细胞表面主要组织相容性复合物I类分子（major histocompatibility complex-I，MHCI），促进MHC-I內吞入胞后在溶酶体被降解，下调肿瘤细胞表面MHC-I水平，进而减少CTLs的浸润。在另一项研究中，发现LDLR调节CD8+T细胞的功能不完全依赖于LDL水平，还可以与T细胞受体（T cell receptor，TCR）相互作用调节TCR信号转导，抑制PCSK9从而上调LDLR水平能够增强CD8+T细胞的抗肿瘤活性[21]。

3.2 PCSK9对肿瘤免疫微环境的调节作用

PCSK9在调节肿瘤相关巨噬细胞的迁移与极化中发挥了重要的作用，巨噬细胞是肿瘤免疫微环境中的重要组成部分，包括肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophage，TAM）、组织驻留巨噬细胞，此外，巨噬细胞可极化为M1和M2型在肿瘤中发挥相反的免疫作用。M2型巨噬细胞能够分泌多种细胞因子介导抑制性免疫微环境，靶向M2型巨噬细胞具有良好的抗肿瘤治疗前景。最新的一项研究发现，PCSK9在体外通过促进肝癌细胞分泌OX40L进而抑制THP-1巨噬细胞迁移并抑制其向M2型巨噬细胞极化[22]。

血管新生是肿瘤的一个重要特征，抗血管生成疗法如抗血管生成因子制剂和靶向受体酪氨酸激酶的抑制剂已开发用于抗肿瘤治疗，主要以血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和血管内皮生长因子受体（vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR）作为靶点。研究发现PCSK9单克隆抗体evolocumab通过增加细胞增殖、迁移、管道形成和VEGF的分泌来促进血管生成，在高浓度下对PCSK9的抑制能显著提高脐静脉内皮细胞的活力[23]，提示evolocumab应用于肿瘤治疗时可能会起到促进血管新生的促肿瘤作用，因此联合使用抗血管生成药物或可能拮抗PCSK9抗体的不良反应，更有利于PCSK9抗体的临床应用。

3.3 PCSK9在非肿瘤疾病中对免疫细胞的调节作用

目前，关于PCSK9在肿瘤免疫微环境中的作用研究有限，在非肿瘤疾病中PCSK9也表现出调节免疫细胞的潜力，可为其在肿瘤免疫微环境的研究进一步进行提示。树突状细胞是免疫系统中功能最强的专职抗原呈递细胞（antigen presenting cells，APCs），是幼稚CD4+T和幼稚CD8+T细胞主要的激活细胞，具有摄取、加工及递呈抗原的能力，并表达MHC和共刺激分子（CD80、CD40、CD86和CD70），进而激活效应细胞[24]。在动脉粥样硬化中，氧化低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein，oxLDL）诱导DCs中PCSK9的表达，促进DCs的成熟，增加CD80、CD83、CD86、HLA-DR和清道夫受体（scavenger receptor，SR）血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体-1（lectin-like oxidized low-density lipoprotein receptor-1，LOX-1）、CD36的表达。该研究将健康人体T细胞与oxLDL诱导后的DCs共培养，发现T细胞IFN-γ和IL-17表达增加，并向Th1及Th17这种具有抑瘤作用的细胞亚群极化。而PCSK9的沉默逆转了oxLDL对DCs和T细胞的影响，表现为DCs的成熟以及TNF-α、IL-1β和IL-6的生成减少，TGF-β和IL-10的分泌增多，并诱导Tregs的产生[25]。该研究为后续对PCSK9在肿瘤免疫微环境中的机制探索提供了新的方向，PCSK9在肿瘤免疫微环境中是否起到同样的作用有待进一步的验证。

关于PCSK9对巨噬细胞的作用，在非肿瘤模型中也有相关报道。Ding等[26]研究发现，将外源性重组PCSK9蛋白与巨噬细胞共孵育，发现PCSK9以剂量依赖性的方式上调清道夫受体SRA、CD36、LOX-1的表达，其中以LOX-1最为明显，清道夫受体是固有免疫中一类重要的模式识别受体，研究表明其会影响CD8+T细胞的脂质代谢进而影响免疫功能[27]，靶向M2型巨噬细胞上的清道夫受体能够激活NK细胞，进而提高肿瘤杀伤能力[28]，因此抑制PCSK9的表达及分泌可能是调节肿瘤相关巨噬细胞的潜在的治疗靶标。此外，有研究发现PCSK9能够调节巨噬细胞的胆固醇摄取[29]，LRP5可与PCSK9形成巨噬细胞胞内复合物，介导PCSK9向胞膜转运。抑制巨噬细胞的PCSK9后，Toll样受体-4（Toll-like receptor-4，TLR-4）蛋白表达水平降低，NF-κB核转位减少，以及TNF-α、IL-1β表达和释放增加，相关炎症通路下调[30]，另一项研究也得到了相同的结果[31]，提示PCSK9在巨噬细胞中充当调节促炎因子的角色，为肿瘤微环境中PCSK9对巨噬细胞的作用探究提供了指示性的研究方向。结合PCSK9抑制M2型巨噬细胞迁移与极化这一研究结果，PCSK9在肿瘤微环境中对巨噬细胞具体的调节作用，以及在调节巨噬细胞的功能中扮演了什么样的角色，仍需进一步探索。

3.4 靶向PCSK9在抗肿瘤免疫治疗的价值

借助人体自身的免疫系统，去攻击肿瘤细胞的治疗方法被称为肿瘤免疫治疗。近年来，免疫治疗在肿瘤治疗领域备受关注，已在多个癌种的治疗中表现出卓越疗效，PCSK9在抗肿瘤免疫治疗中也表现出潜在的价值。在两项临床前研究中，研究者在小鼠荷瘤模型中分别联合使用了PD-1抗体和PCSK9抗体/PCSK9小分子抑制剂，结果比单用PD-1抗体或单用PCSK9抗体/PCSK9小分子抑制剂的疗效更好[20-21]，其作用机制与抑制PCSK9导致CD8+T细胞浸润增多以及效应功能增加相关。有研究发现，在胃癌、食管癌、肠癌、肺癌、乳腺癌患者的血清中PCSK9抗体均高于健康人，血清高PCSK9抗体食管癌患者在行根治术后预后更好，并且血清PCSK9抗体水平的升高与PD-L1水平呈正相关[32]，提示在临床使用PCSK9抗体后PD-L1水平可能会升高，因此联合使用PDL1抗体或许能达到更好的抗肿瘤疗效。

近期，靶向PCSK9的疫苗在肿瘤动物模型中也取得了较好的疗效，相较PCSK9单克隆抗体而言，PCSK9疫苗克服了半衰期短、成本高的缺点。研究者将PCSK9短肽（作为B细胞表位）与破伤风毒素肽（作为辅助性T细胞表位）偶联到纳米脂质体表面，以提高其免疫原性[33]。研究发现，PCSK9纳米脂质体疫苗在体内能有效地诱导PCSK9特异性抗体，降低血液中PCSK9的水平，在乳腺癌和结肠癌荷瘤小鼠中，该疫苗可以显著抑制肿瘤生长，延长荷瘤小鼠生存时间，并且未出现明显的毒副作用，安全性较好[34-35]。

4 结语

综上所述，PCSK9在多个癌种中可作为独立的预后因子，通过调节肿瘤细胞增殖与凋亡、侵袭和转移、提高放疗耐受性等方式在不同类型的肿瘤中起到促肿瘤作用，并且能够直接或间接影响多种免疫细胞的肿瘤浸润和功能活性。PCSK9抗体联合使用免疫检查点抑制剂以及使用靶向PCSK9的纳米脂质体疫苗已在动物模型中取得良好的治疗疗效，目前，PCSK9抗体应用于部分肿瘤，如晚期胰腺癌、晚期脑胶质瘤的临床试验也在进行中，旨在探索其对化疗和免疫治疗的协同作用。虽然PCSK9抗体有一定的临床应用前景，但目前仍有许多问题亟待阐明。此外，PCSK9在肿瘤免疫治疗中的作用初露头角，研究发现其在肿瘤动物模型中可以调节T细胞的浸润与功能，在非肿瘤动物模型中可以影响DC、巨噬细胞的代谢及功能，关于PCSK9对肿瘤微环境中其他免疫细胞是否有影响，以及关于免疫治疗更多样的靶向PCSK9治疗方式，如联合回输特异性肿瘤杀伤细胞等是否能达到更好的疗效仍然未知，需更深层次的探索。