基于外泌体蛋白质组学探讨叶酸缺乏对N2a-APP细胞β-淀粉样蛋白的影响☆

樊珺婷 董翠霞 黄丽 张美琳 刘欢

阿尔茨海默病（Alzheimer disease,AD）以β-淀粉样蛋白（amyloid-β,Aβ）在神经元沉积形成老年斑为主要病理特征[1]。外泌体是来自内体的膜囊泡，接收并分泌Aβ至细胞外，参与形成老年斑[2]。叶酸缺乏与AD发生发展密切相关，其作用机制与叶酸缺乏导致细胞外Aβ沉积有关[3]。有研究表明，脂肪酸的营养素可影响外泌体的分泌[4]。叶酸缺乏可引起细胞氧化应激[5]，促进来自内体的自噬体形成[6]。细胞氧化应激和自噬改变都会影响外泌体分泌[7]。以上研究提示，叶酸缺乏导致细胞外Aβ增加，可能与外泌体分泌有关。外泌体起源于内体，其内容物可反映细胞内物质变化[7]。近期研究表明，基于质谱的蛋白质组学分析可确定外泌体的蛋白质组学特征[8]。本研究拟观察叶酸缺乏对转基因小鼠神经细胞内外Aβ水平和外泌体分泌的影响，基于蛋白质组学分析外泌体内容物的改变，探讨叶酸缺乏促进AD的分子机制。

1 材料与方法

1.1 细胞材料 本研究采用稳定转染APP695质粒的小鼠成神经瘤细胞（N2a neuroblastoma cells overexpressing APP695,N2a-APP），由厦门大学许华曦教授提供。将复苏的N2a-APP细胞在10%胎牛血清（FBS）和1%青/链抗生素无叶酸（0 μmol/L）DMEM培养基（北京源培生物有限公司）或添加叶酸（10 μmol/L）DMEM培养基培养72 h，即为叶酸缺乏（folic acid deficiency，FD）组和叶酸正常（folic acid normal，FN）组。将以上细胞在相应叶酸浓度无外泌体培养基培养24 h，以去除培养基中外源性外泌体对实验结果的影响，收集细胞培养液用于后续分离外泌体。

1.2 方法

1.2.1 细胞内外Aβ水平检测 取细胞及细胞培养液，使用检测Aβ1-40、Aβ1-42的酶联免疫吸附测定试剂盒（上海酶联生物有限公司），参照说明书加入50 μL标准品和样本，以及其他工作液，用酶标仪测定λ为450 nm处的吸光度值，根据标准曲线计算Aβ1-40、Aβ1-42浓度。

1.2.2 外泌体提取 将细胞培养液上清与总外泌体提取试剂（美国invitrogen公司）以2∶1的比例混匀。经4°C孵育16 h，离心10000 g，静置1 h后弃上清，PBS吹打混匀沉淀。0.22 μm无菌滤器过滤悬液，再以2∶1比例加入总外泌体提取试剂，重复孵育离心步骤，沉淀即为外泌体。

1.2.3 外泌体鉴定 采用电镜观察、粒径分析的方法鉴定外泌体。电镜鉴定：用PBS稀释外泌体，取10 μL稀释液于塑料薄膜上，将载样铜网倒置于薄膜上，室温吸附3 min，滴加2%磷钨酸染液10 μL于铜网上，风干铜网上液体，120 kV透射电子显微镜观察外泌体形态，并拍照和保存。粒径分析：收集外泌体，PBS稀释，使外泌体颗粒浓度在106～109/mL。取200 μL稀释液注入样本池，用纳米颗粒跟踪分析仪进行检测。

1.2.4 Western blot检测蛋白 采用Western blot法检测外泌体标志蛋白CD63和Flotillin-1，以及细胞内自噬相关蛋白Beclin-1、p62和LC3II/I。收集细胞和外泌体，提取细胞和外泌体蛋白后，BCA法检测蛋白浓度。LC3使用15%十二烷基硫酸钠-聚丙烯胺凝胶电泳，其他蛋白采用10%凝胶电泳，将蛋白质电转至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭1 h，加入一抗LC3、Beclin-1、p62（均采购于美国CST公司）、CD63（美国Abcam公司）和Flotillin-1（美国CST公司）（1∶1000稀释）以及GAPDH（美国CST公司）（1∶5000稀释）单克隆抗体，4℃孵育过夜，洗涤3次，加入二抗山羊抗兔HRP（山东思科捷生物技术有限公司）（1∶10000稀释），37℃孵育1 h，滴加显影液显色，ImageJ软件分析条带光密度值。

1.2.5 外泌体非标记定量蛋白组学分析 裂解外泌体和BCA蛋白定量后，进行丙酮沉淀、蛋白重溶、还原、烷基化以及酶解。对脱盐处理后的多肽，用nano-UPLC液相系统EASY-nLC1200进行分离，并使用Q-Exactive质谱仪检测。由上海康成生物工程有限公司完成蛋白组学分析。

1.3 统计学方法和生物信息学分析 采用SPSS 25.0进行统计学分析。数据符合正态分布，以±s描述，组间比较采用独立样本t检验，检验水准α=0.05。使用MaxQuant（1.6.1.0）和 UNIPROT数据库（uniprot-mouse-20200526）进行蛋白质组学分析和生物信息分析，如GO富集分析。为控制质量及避免出现假阳性，以表达倍数差异≥1.5，唯一性肽段≥2，且经错误发现率（false discovery rate，FDR）校正检验差异有统计学意义的蛋白，视为差异蛋白。

2 结果

2.1 N2a-APP细胞内外Aβ 与FN组相比，FD组细胞内Aβ1-40（t=-7.218，P＜0.001）、Aβ1-42（t=-5.041，P=0.001）表达水平升高，细胞外 Aβ1-40（t=-4.754，P=0.001）、Aβ1-42（t=-3.784，P=0.004）表达水平同样升高，差异有统计学意义。见表1。

2.2 外泌体鉴定结果与外泌体蛋白浓度 透射电镜显示两组N2a-APP细胞培养基上清物质，粒径50～200 nm，呈双层膜样结构，形状不一，呈茶托形、凹陷半球形、类圆形和圆形。符合外泌体形态特征，表明所提取的物质为外泌体。FD组外泌体粒径为（157.7±53.3）nm，粒径主峰为122.9 nm；FN组外泌体粒径为（161.9±60.8）nm，粒径主峰为114.8 nm。见图1。

BCA检测外泌体蛋白浓度如表2所示，FD组外泌体蛋白浓度为（637.56±47.31）μg/mL，FN组外泌体蛋白浓度为（365.76±76.21）μg/mL，两组相比差异具有统计学意义（t=-6.909，P＜0.001）。Western blot表明FD组和FN组细胞分泌的物质均有外泌体特异性蛋白CD63和Flotillin-1表达。见图2。

2.3 外泌体差异蛋白表达 利用非标记定量技术，对N2a-APP细胞分泌的外泌体进行蛋白质组学的高通量筛选。经数据库检索，总共鉴定1303种蛋白质，鉴定出50种差异蛋白，其中14种蛋白在FD组表达下调，36种蛋白表达上调。见表2。

表2 FD组与FN组相比的外泌体差异蛋白

2.4 生物学信息分析 为探究叶酸缺乏可能对外泌体蛋白参与的生物过程、分子功能和细胞组分的影响，将差异蛋白进行GO富集分析。差异蛋白主要参与的生物过程有：细胞内外以及细胞膜蛋白定位的调控、囊泡在高尔基体中运输等。差异蛋白主要位于多肽酶复合体、蛋白酶复合体等细胞组分。差异蛋白发挥的生物功能主要有：与热休克蛋白结合、与钙粘蛋白结合等。GO富集分析结果见图3。

2.5 细胞自噬水平 Western blot检测N2a-APP细胞内自噬相关蛋白相对表达水平，与FN组相比，FD组细胞内Beclin-1（t=-6.339，P＜0.001）和LC3II/I（t=5.396，P=0.002）表达水平升高，差异有统计学意义，FD组细胞内p62蛋白表达水平降低，差异有统计学意义（t=-4.162，P＜0.001）。见表3。

表3 两组N2a-APP细胞内自噬相关蛋白表达水平

3 讨论

前期研究发现，叶酸缺乏可上调AD动物模型脑组织中淀粉样前体蛋白基因的表达[9]，降低DNA甲基转移酶的活性[10]，使Aβ生成增多和堆积[9]。本研究发现，FD组N2a-APP细胞内和细胞外Aβ1-40与Aβ1-42水平均高于FN组，表明叶酸缺乏可促进N2a-APP细胞中Aβ的生成和向胞外分泌。

本研究中FD组和FN组N2a-APP细胞分泌的物质均有外泌体特异性蛋白CD63和Flotillin-1表达，该物质的电镜形态特征和粒径大小均符合外泌体特征，说明在有或无叶酸的条件下，N2a-APP细胞均可分泌外泌体。有研究发现N2a细胞可通过外泌体分泌Aβ[2]。本研究中FD组外泌体蛋白浓度高于FN组，且与两组细胞外Aβ1-40、Aβ1-42水平变化一致，提示叶酸缺乏可影响外泌体的分泌，从而调节Aβ转运。

细胞对叶酸的摄取，由叶酸转运蛋白溶质载体（SLC）家族介导[11]。本实验通过外泌体蛋白质组学研究发现，FD组外泌体中二氢叶酸还原酶（DHFR）表达上升和叶酸转运蛋白家族SLC7A1成员表达下降，提示细胞处于叶酸缺乏状态，且叶酸转运功能受损。已知，氧化应激可影响外泌体分泌[7]。本研究发现，参与氧化应激反应的PYCR1和TXNL1在FD组外泌体中上升，推测叶酸缺乏引起的外泌体分泌增多与氧化应激状态有关。

本研究外泌体蛋白组学分析结果表明，叶酸缺乏可影响VPS29、BAG6、HASP1A、MAP2K1等蛋白的表达，这些差异蛋白所在的蛋白家族均与自噬密切相关[12-14]。例如，VPS29组成逆转录酶复合体货物识别核心，参与细胞内蛋白质的分选和运输[15]。BAG6具有与LC3结合的结构，可结合自噬体[16]。HASP1A相关蛋白HSC70为自噬途径的伴侣蛋白[17]。因此，本研究结果提示叶酸缺乏可引起细胞自噬改变。

自噬增加可促进Aβ分泌[18]，而自噬缺乏会导致多泡体中Aβ减少[19]。为进一步验证叶酸缺乏对N2a-APP细胞自噬的影响，本研究对自噬相关蛋白进行检测，结果发现FD组细胞自噬水平增高，与细胞内外Aβ含量变化一致。外泌体与自噬共享内体网络[7]，干扰自噬会影响外泌体的产生和释放。Beclin-1可与VPS29同一家族的VPS34形成自噬体[20]，本研究发现FD组细胞内Beclin-1表达与外泌体中VPS29表达趋势相同。因此，叶酸缺乏引起的Aβ和外泌体分泌增多均可能与自噬增强有关。

综上所述，FD组细胞内外Aβ1-40和Aβ1-42水平高于FN组，与外泌体分泌量、细胞内自噬水平变化一致，提示叶酸缺乏可能通过直接增强自噬，也可能通过自噬间接调节外泌体分泌，促进细胞分泌Aβ。以上结论是通过观察细胞内外物质变化的相关性得出的，缺乏进一步验证，因此叶酸缺乏影响外泌体分泌Aβ的机制需要进一步探究。