针刺治疗弱视的相关蛋白质分子研究进展

牛野，魏丽娟，王富春

弱视是在视觉发育敏感期由于斜视、屈光参差、形觉剥夺等原因导致的空间视觉不良综合征[1]，斜视性弱视和屈光参差性弱视的动眼神经功能更差[2]，而形觉剥夺性弱视是视皮层功能障碍[3]，也是儿童单眼视力减退的主要原因，被认为是最常见的一种成年后持续性单方面视力障碍的原因[4]，严重影响儿童视觉的健康发展。蛋白质磷酸化是生物体内最重要的一种蛋白质翻译后修饰，应用蛋白质修饰开展针刺治疗弱视的效应机制研究日益受到重视，本文分析针刺、弱视与相关蛋白质磷酸化之间的关系，认为针刺在蛋白质组学方面的作用是未来研究弱视的重要突破口和发展方向，同时也为临床针刺治疗弱视提供思路。

1 弱视研究进展及针刺治疗优势

《弱视眼科临床指南（2017 年）》[5]指出：“形觉剥夺性弱视是由于屈光间质混浊、上睑下垂等形觉剥夺性因素造成的弱视，可为单眼或双眼，单眼形觉剥夺性弱视较双眼弱视后果更为严重。”据各国统计资料显示，其发病率大约在1%～4%[6-7]，并且被认为是成年后持续性单侧视觉障碍的最常见原因之一[4]。

弱视是一种视觉皮层障碍，其中视皮层的可塑性与神经元的突触有着密切的联系[7-8]，相关因子通过对神经元突触的干预从而完成视觉系统可塑性的调控。相关因子包括神经递质[9-10]、眼优势柱调节激酶[11]、细胞外基质（extracellular matrix，ECM）等。目前国际治疗弱视的方法主要为“压抑疗法”和“遮盖疗法”[12]，针灸是中医学的一部分，作为弱视的潜在治疗方法备受关注。相关研究[13]已经证明，针灸能通过刺激视觉相关穴位来改善血流和诱导视皮层功能，针刺干预可以调节视中枢的神经递质[14]，神经元的核膜、线粒体、突触形态结构逐渐恢复，同时可以改变脑源性神经营养因子（brian derived neurotrophic factor，BDNF）[15-16]，从而达到改善视皮层可塑性的目的。本研究通过搜索近年来针刺治疗弱视效果的相关文献，分析得出针刺在治疗弱视方面具有良好的效果[17]，基因方面以N-甲基-D-天门冬氨酸受体（N-methyl-D-aspartate receptor，NMDAR）信使核糖核酸（messenger ribonucleic acid，mRNA）、即刻早期基因（immediate early genes，IEGs）c-fos 表达为主，蛋白方面以神经生长蛋白-43（growth associated protein-43，GAP43） 为主，蛋白酶方面以神经元型一氧化氮合酶（neuronal nitric oxide synthase，nNOS）为主的针灸干预效果显著[18-20]。

2 弱视与磷酸化翻译后修饰蛋白质组学

近年来，随着蛋白质组学的出现及其分析技术的不断发展和完善，使研究者开展弱视相关蛋白质组学的研究成为了现实，神经活性被证明可以诱导组蛋白的翻译后修饰[21-22]，RUIZ-PERERA L 等[23]通过对单眼剥夺弱视小鼠模型进行了蛋白质组学分析，识别出弱视中24 个差异表达的蛋白质，主要为肌动蛋白相关蛋白2、抑制蛋白2、钙调素、翻译控制的肿瘤蛋白（translationally-controlled tumor protein，TCTP）、蛋白酶体亚基α2 型等，以此为治疗的突破口进行机制研究。CHWANGW和WOODMA 等[24-25]研究发现体外激活细胞外信号调节激酶/丝裂原活化蛋白激酶 （extracellular signal regulated kinases/mitogen-activated protein kinases，ERK/MAPK）显著增加海马CA1 区组蛋白H3 磷酸化，组蛋白H3 的Ser10和Lys9 的组合磷酸化与可塑性相关基因的活性基因转录相关，同时CROSIO C 等[26]发现重置昼夜节律刺激会导致视交叉上核H3 磷酸化，在不同的大脑结构中发生改变，而神经系统中染色质重塑对组蛋白H3 的磷酸化起着至关重要的作用。SANANBENESI F 等[27-28]观察到了经验依赖性丝氨酸/苏氨酸激酶磷酸化和细胞外调节蛋白激酶的磷酸化，其改变影响了神经系统的可塑性。通过筛选形觉剥夺弱视的特异性标志物，明确弱视治疗靶点以及判断其病情的发展情况，进一步地深入了解了弱视的发病机制，为其诊断、治疗和预后带来新思路[29]。

2.1 弱视与nNOS 的磷酸化

视皮层神经元的可塑性对于弱视的治愈至关重要[30-33]。神经元相互作用和视皮层可塑性持续改变的关键是突触发生了分子变化，一氧化氮（nitric oxide，NO）在突触后神经元中作为无机小分子是神经系统细胞间的信使分子，参与神经系统的信息传递、神经发育，促进L-谷氨酸和γ-氨基丁酸（γaminobutyric acid，GABA）经典神经递质的释放，从而影响突触的可塑性[34-40]，经研究[41]发现突触后NO 的产生不但影响突触的可塑性，同时对神经元的死亡也产生重要影响，而NMDAR 的信号传导在突触可塑性和细胞死亡机制中也起着重要作用，通过NMDAR 刺激神经型nNOS 产生NO[42-45]，这个过程要激活nNOS 的活性。

RAMEAU GA 等[46-47]验证了谷氨酸刺激神经元对nNOS磷酸化的影响，通过蛋白激酶B 快速诱导丝氨酸1412 的位点蛋白（S1412）和短暂的NMDAR 依赖性磷酸化，然后通过钙调蛋白依赖性激酶II（calcium/calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ，CaMKII）诱导丝氨酸847的位点蛋 白（S847）持续磷酸化[48]，证明了蛋白激酶B 磷酸化S1412 蛋白是NMDAR激活nNOS 的必要条件。这些发现[49-51]表明NMDAR 诱导的一系列调控nNOS 磷酸化在nNOS 活体控制中起着关键作用。

α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸受体（α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isox-azolepropionic acid receptor，AMPAR）蛋白磷酸化在神经元可塑性中同样发挥重要作用[52]，AMPAR 是离子型谷氨酸受体中重要的亚型，AMPAR 由4 种亚单位组成，GluR1 至GluR4 或GluRA 至GluRD，AMPAR 的数量及对Ca2+的通透性最终影响突触的强度，Ca2+通过NMDAR 流入，从而导致CaMKII 活化，CaMKII 对神经元突触的长时程增强（long-term potentiation，LTP）至关重要，通过各种蛋白质磷酸化参与突触传递。LTP 的诱导增加了CaMKII 对GluR1 的磷酸化，AMPAR 的磷酸化和调节在LTP 期间发生的突触功效中起着重要作用[53]，AMPAR 磷酸化促进NMDAR依赖性磷酸化，从而间接调控nNOS 磷酸化。

2.2 弱视与GAP43 的磷酸化

GAP43 是与神经系统发育、再生、神经突触连接重建及可塑性密切相关的一种特异性磷酸蛋白。由于其在引导轴突生长和调节轴突形成新的连接上起非常关键作用，因此被认为是神经元发育、轴突再生、突触重建的可塑性分子标志[54-55]。在突触后的信号转导过程中，蛋白激酶C （protein kinase C，PKC）磷酸化的花生四烯酸（arachidonic acid，AA）激活多种底物，包括GAP43[56]，已知其通过调节肌动蛋白动力学促进神经元生长[57-58]，在体外研究中，当PKC 磷酸化时，GAP43 通过增加聚合来调节肌动蛋白丝的长度，从而调节视网膜枝干的发育。在细胞水平上，GAP43 在称为脂筏的特定区域控制肌动蛋白，GAP43 及其磷酸化在视觉神经系统发育和可塑性过程中起重要作用[59-60]。

2.3 弱视与c-fos 的蛋白表达

c-fos 是一种即刻早期基因，具有被刺激诱导快速短暂表达的特性，其产物蛋白的表达水平可以反映视皮质神经元突触可塑性程度[61-62]，同时c-fos 也参与细胞的生长和分化。陈剑等[63]通过免疫组织化学法，观察单眼斜视大鼠视觉发育敏感期内视皮质神经元c-fos 蛋白的表达情况，发现弱视大鼠通过光等外界条件刺激后，c-fos 蛋白的表达明显增多，从而可知斜视导致的弱视大鼠视觉发育敏感期内视皮质仍然存在一定的可塑性。王今乐等[64]通过实时荧光定量PCR 技术检测单眼剥夺弱视猫视皮质神经元c-fos 的表达，发现在单眼剥夺关键期的c-fos 表达明显降低，通过相关研究证实c-fos的表达是神经元突触可塑性的重要标志。

3 针刺与弱视的蛋白质组学

随着质谱技术的不断发展，越来越多的蛋白质翻译后修饰类型被鉴定出来。蛋白质翻译后修饰在不同的生物过程中发挥着至关重要的作用[30]，如细胞调节分化和有机体发育等，且与弱视相关的蛋白质能以不同方式进行修饰，如乙酰化、甲基化和磷酸化，磷酸化常见的修饰是调节蛋白质的功能和定位[31]。周丹[65]研究针刺对形觉剥夺弱视模型大鼠蛋白质的影响，选出差异表达蛋白3 种，并认为“开导补益”针刺法治疗形觉剥夺弱视优于开导组及补益组，机制可能与多种蛋白的表达变化有关。上述研究从蛋白质组的整体变化揭示针灸防治弱视的分子基础，对阐明针灸治疗弱视的现代生物学机制具有较好的参考和指导意义[66]。

3.1 针刺与nNOS 的表达

nNOS 在神经元突触的可塑性方面起着重要作用[67]，已在临床治疗儿童视力损伤得到证实[68]。沈非儿等[69]使用电针刺激大鼠的百会穴和印堂穴，发现可以降低模型组大鼠海马区nNOS 的表达，影响突触的可塑性从而实现对抑郁的改善。胡英华[70]研究发现在视觉剥夺早期，针刺能够促进视皮质和外侧膝状体nNOS 表达，其表达量的变化在不同程度上促进了视觉系统的发育，从而改善整个视觉系统的功能。何峰等[71]发现老龄组大鼠海马CA1 区的神经元型nNOS 较幼年和成年组表达水平均降低，提示老龄期nNOS 表达下降可能是导致学习记忆能力下降的原因之一。程为平等[72]通过针刺百会穴和大椎穴发现其能抑制nNOS 的激活，从而减轻其对海马神经元的毒性作用，达到抑制神经元凋亡的目的。以上可以看出nNOS 对神经元突触可塑性至关重要，而神经元突触可塑性不但影响视皮层功能进而最终导致弱视，还会影响海马区，造成抑郁和老年痴呆的发生，通过针刺干预nNOS 的表达，可以达到治疗疾病的目的。

3.2 针刺与GAP43 的表达

GAP43 是神经元发育和突触可塑性的内在因素，林栋[73]采用针刺干预缺氧缺血大鼠模型，发现损伤后在应激情况下会出现GAP43 的高表达，通过针刺干预后会有效降低GAP43 阳性细胞数量。孙迎春和陈英辉等[74-75]通过电针刺激脊髓损伤大鼠，发现GAP43 是神经元生长期的内在决定因子，标志着神经的再生，突触的形成。梁佳[76]通过电针治疗慢性应激抑郁大鼠，发现电针可以上调海马组织GAP43 的表达水平，从而促进海马神经元再生、减少海马神经元凋亡。综上所述，GAP43 在神经元发育和突触可塑性的重塑过程中发挥重要作用，无论是脑瘫、抑郁还是弱视等疾病中GAP43 表达的改变对疾病均起着一定的作用，而通过针刺干预，可以调节相应动物模型GAP43 的表达，从而提高神经元的发育和突触重塑性。

3.3 针刺与c-fos 的表达

c-fos 作为一种即刻早期基因，是神经元突触可塑性的重要标志。研究[77]发现，对脑缺血再灌流大鼠进行电针干预治疗后，其病灶侧额叶、顶叶皮层和海马区的c-fos 表达明显增多，减少了神经元的变性坏死，改善了神经系统功能障碍。相似的是，覃波等[78]应用电针干预脑梗死模型大鼠，发现其患侧海马区c-fos 表达和神经元数量明显增多，提示通过电针刺激可以增加c-fos 的表达，修复神经元数量，达到改善机体神经系统功能的目的。

4 小结

弱视的治疗在蛋白质修饰过程中是一个复杂的过程，视皮层中主要因子nNOS、GAP43 和c-fos 均对神经元的突触可塑性有着重要作用。通过整理近几年的相关文献可以发现，通过针灸干预后的nNOS、GAP43 和c-fos 表达均有不同程度的改变，同时对神经元的突触可塑性也产生的一定的修复作用。但是目前尚不明确针灸治疗弱视的机制和分子通路，因此需要进一步研究针灸干预后相关表达蛋白变化和其磷酸化修饰的改变，为针灸干预预防弱视及定向治疗弱视提供理论支持。