荧光短片段多重PCR在脊髓性肌萎缩症SMN1基因突变检测中的应用☆

杨慧 李桂河 谢颖璇 陈海珠 李世举 何瑾

脊髓性肌萎缩症（spinal muscular atrophy,SMA）临床表现变异大，以肌无力和肌萎缩为特征，呈进行性、对称性，近端受累为著。其诊断主要依赖临床表现、家族遗传史、实验室检查及基因检测。但因其临床表现与检验检查缺乏特异性，因此基因检测在SMA诊断上发挥了巨大作用[1-2]。SMA的致病基因为位于5q13的运动神经元生存1（survival motor neuron 1,SMN1）基因[3]，95%的患者表现为SMN1基因纯合缺失[4]。SMN1基因拷贝数的检测是诊断SMA患者与筛查携带者的重要依据。SMN2基因，与SMN1基因高度同源，仅有5个碱基的差异[5]，给基因检测带来困难。目前反义寡核苷酸药物诺西那生钠（nusinersen）和小分子化学药物利司扑兰（risdiplam）已在我国上市，药物的可及性使得临床可疑的SMA患者亟需快速高效的基因检测方法，其有助于尽早明确诊断。

目前临床上对SMA常规基因检测有聚合酶链反应-限制性片段长度多态性技术（polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism,PCR-RFLP）、实时荧光定量PCR技术（realtime PCR）和多重连接依赖性探针扩增技术（multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA）[6-8]。但各有缺点：PCR-RFLP技术仅能检测SMN1基因的纯合缺失，无法检测SMN1基因的拷贝数；实时荧光定量PCR技术仅采用一对内参基因，误差大；MLPA技术可同时设计多对内参基因进行比较，但成本高、耗时长。综上，为提高精确性和效率，需要提供一种脊髓性肌萎缩症相关基因突变检测方法。因此，本研究设计了一种脊髓性肌萎缩症相关基因突变检测引物，仅需通过荧光短片段多重PCR反应和片段分析，对脊髓性肌萎缩症SMN1基因突变进行快速精确的检测。

1 对象与方法

1.1 研究对象 该研究纳入了来自福建省神经病学研究所神经系统疾病生物样本库107例包括脊髓性肌萎缩症患者（n=30）、脊髓性肌萎缩症携带者（n=47）以及正常对照（n=30）的DNA样本。所有患者、家系成员、正常对照人员签署知情同意书。伦理审查批件号2021（141号）。

1.2 基因组DNA提取 抽取上述研究对象外周静脉血2 mL，ACD抗凝，用QIAamp®DNA抽提试剂盒（德国QIAGEN公司）抽提基因组DNA，操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。

1.3 多重连接依赖性探针扩增技术

1.3.1 MLPA扩增及检测 MLPA P060试剂盒（荷兰MRC-Holland公司）共包含21对探针，包括17个参考探针和4个检测探针，其扩增产物在154和342 nt之间，分别用于SMN1基因拷贝数和SMN2基因拷贝数的检测。操作步骤参考试剂盒说明书进行，通过杂交、连接、扩增以及片段分析四个步骤进行。

1.3.2 MLPA数据分析 毛细管电泳分离结果用Coffalyser软件分析，并导出图形及数据。当拷贝数比值临近波动范围边界时行重复验证以确保结果准确。

1.4 荧光短片段多重PCR

1.4.1 引物设计 包括一对特异性扩增SMN1基因7号外显子的引物及三对扩增内参基因的引物（表1）。

表1 荧光短片段多重PCR反应引物序列

1.4.2 荧光短片段多重PCR反应 根据上述FAM标记的引物，同时对SMN1基因以及三对内参基因进行荧光短片段多重PCR。PCR反应液体系如下：ddH2O 1 μL，2×Buffer I 12.5 μL，25 mmol/L MgCl21 μL，10 mmol/L dNTP 1 μL，10 μmol/LSMN1基因引物 1.5+1.5 μL，10 μmol/L 内参基因引物各1+1 μL，LaTaq酶0.25 μL（5U/μL）。上机检测（ABIVeriti，美国ThermoFisher Scientific公司），反应条件：96℃ 3 min；96℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，23个循环；72℃ 10 min。

1.4.3 基因分析仪检测 使用ABI 3730（美国ThermoFisher Scientific公司）基因分析仪检测PCR片段，反应体系：9 μL去离子甲酰胺（美国Thermo-Fisher Scientific公司），0.2 μL 500LIZ Size Standard，0.7 μL PCR产物。基因分析仪参数设置：run module：Fragment Analysis，injection voltage：1.6 kV，injection time：15 s，run voltage：15 kV，run time：1800 s，oven temperature：60℃，polymer：POP7。利用基因分析仪收集荧光短片段多重PCR产生的荧光信号，并导出图形及数据。

1.5 数据分析 采用Genemapper 5.0或Peak Scanner软件[9]，将SMN1基因7号外显子片段峰面积除以三对内参基因片段峰面积和，即为该目的片段的相对峰面积（relative peak area,RPA），再将病例组RPA与正常对照RPA相比，即为拷贝数比值，进而可计算出该目的片段的拷贝数。0拷贝数比值即0拷贝，代表SMN1纯合缺失；0.40～0.65拷贝数比值即1拷贝，代表SMN1杂合缺失；0.80～1.3拷贝数比值即2拷贝，代表SMN1拷贝数正常；拷贝数比值为0.00～0.40或0.65～0.80，需重新检测。

2 结果

2.1 荧光短片段多重PCR扩增SMN1基因7号外显子以及3对内参基因片段 本实验应用荧光多重PCR技术结合特异性扩增SMN1基因7号外显子及3对内参基因的引物，成功实现了SMN1基因的拷贝数的检测。其中特异性扩增SMN1基因7号外显子的目的片段为307 nt，内参基因MLH1片段大小为209 nt，CFTR片段大小为245 nt，KRIT1片段大小为325 nt。通过检测得到的RPA与与正常对照RPA相对，计算分别得到0拷贝、1拷贝、2拷贝样本。

2.2 荧光短片段多重PCR对107例样本SMN1基因7号外显子拷贝数进行定量分析 对收集的107例DNA样本进行荧光多重PCR技术检测，其中包括30个MLPA检测结果提示SMN1基因纯合缺失（0拷贝）的样品，47个MLPA检测结果提示SMN1基因杂合缺失（1拷贝）的样品，以及30个MLPA检测提示SMN1基因拷贝数正常（2拷贝）的样品。将该方法检测出的SMN1基因拷贝数与MLPA的结果进行比较（见表2），数据分析显示，两种方法检测结果高度一致，证明荧光短片段多重PCR反应能够精确定量SMN1基因的拷贝数，且准确度和灵敏度较高（图1）。

图1 荧光多重PCR技术（A1/2/3图）与MLPA（B1/2/3图）检测SMN1基因拷贝数对比

表2 荧光短片段多重PCR与MLPA检测SMN1基因7号外显子拷贝数比值

3 讨论

本研究设计了三对内参基因引物与SMN1基因7号外显子特异性引物，其引物5’端均带有FAM荧光基团，进行荧光短片段多重PCR并应用基因分析仪收集相应片段荧光信号进行基因突变分析。根据SMN1基因7号外显子序列设计特异性扩增SMN1基因引物，由于SMN1基因和SMN2基因高度同源性，仅有5个碱基差异，故特异性扩增SMN1基因的上游引物序列3’端包含位于7号外显子c.844C＞T差异位点，下游引物序列3’端包含位于7号内含子g.27269A＞C差异位点，并且下游引物3’端倒数第二为碱基错配为C。这种引物设计能够提高PCR扩增SMN1基因的特异性，检测结果不受SMN2基因影响。同时将目的基因与三对内参基因比较，多对内参基因比较结果准确性优于实时荧光定量PCR技术仅用单一内参。本研究巧妙应用带荧光标记引物进行多重PCR反应，避免了MLPA技术复杂的探针杂交、连接、扩增步骤，提高了检测效率。且该多重PCR反应的重复性较好，未见拷贝数比值为0.00～0.40或0.65～0.80的情况。

荧光短片段多重PCR利用反应中不同的引物对，对多个靶向区域进行特异性扩增，之后通过仪器通道对几种不同的荧光基团组合的检测，实现对PCR体系中多个靶标的同时诊断[10]。其常用Taqman探针，在双端分别标记不同荧光基团或淬灭基因，靶标与探针实现成功结合即可发出荧光信号，反之荧光信号即被淬灭。该技术具有高效、简易、低成本等优势。早在2000年，WELLER等[11]即以TaqMan探针为基础，对青枯菌进行了两重PCR扩增和检测，成功鉴定了其菌株。在随后的时间内，该技术在病原体分型鉴定、遗传病筛查、病毒快速检测等方面发挥了重要作用。在病原体分型鉴定方面，2018年，SUN等[12]利用荧光短片段多重PCR技术，建立了两个独立的PCR体系，在114例狗粪便样本中成功鉴定了犬细小病毒的四种抗原类型，通过DNA测序进行验证，其准确率为100%。在遗传病筛查方面，2013年，胡晞江等[13]使用荧光短片段多重PCR技术对198例唐氏综合征患儿外周血淋巴细胞21号染色体的6个短串联重复序列位点进行扩增及核型分析，其敏感性为99.0%,特异性为100%。在病毒快速检测方面，2022年，罗丹等[14]对502例急性呼吸道感染患儿的鼻咽拭子样本进行荧光短片段多重PCR方式检测，结果显示，样本阳性率为23.5%，混合感染率为11.4%，与测序结果相符。综上，结合脊髓性肌萎缩症的特点及荧光短片段多重PCR的原理应用，该技术可有助于提高肌萎缩症相关基因突变检测的效率与准确性。

近年来随着分子生物学技术的飞速发展，涌现出不同新型的SMA基因诊断手段。二代测序技术（next-generation sequencing,NGS）不仅可以分析SMN1基因拷贝数，也可检测SMN1基因的微小突变，且NGS技术可利用SMN1和SMN2基因的单核苷酸变异来区别二者，使用多个内参基因为对照分析可信度高，有利于提高诊断率，有助于新生儿携带者筛查[15]。另外，微滴式数字PCR（droplet digital PCR,ddPCR）技术也显示出独特的优势，可利用微量DNA精确诊断，可重复性强，克服MLPA难以确定的拷贝数情况[16]。

因此，SMA的分子诊断需要结合不同检测手段，并不断进行改良。本研究采用的荧光短片段多重PCR技术，不仅可以检测SMN1基因纯合缺失情况，还能检测SMN1基因拷贝数变异情况，能辅助SMA患者临床诊断，还可用于大规模携带者筛查。与现有方法相比，检测结果更快速、精确，成本低，满足临床低成本高准确性的检测要求，另外，该技术今后也可应用于SMN2基因拷贝数的检测，以进一步明确SMA患者基因型与表型的关系。