氨基甲酸酯类农药和抗生素对细菌的联合毒性

陈森旺，马欣怡，任敏慧，陈杭哲，张从洲，吕露，毛玉琴*

(1.浙江树人学院 生物与环境工程学院，浙江 杭州 310015；2.浙江省农业科学院 农产品质量安全与营养研究所，浙江 杭州 310021)

氨基甲酸酯类(CMs)农药因具有选择性强、高效、广谱、对人畜低毒、易分解和残毒少的特点，被广泛地应用于农业、林业、牧业等诸多领域[1]。CMs农药是从氨基甲酸衍生而来，是在有机磷酸酯之后发展起来的合成农药，常用的有4类：(1)萘基氨基甲酸酯类；(2)苯基氨基甲酸酯类；(3)氨基甲酸肟酯类；(4)杂环二甲基氨基甲酸酯类[2]。据统计，CMs农药的使用量已超过有机磷农药，销售额仅次于拟除虫菊酯类农药，位居第二[3]。CMs农药对生态环境的污染是多方面的，因此，研究典型CMs农药对细菌抗生素抗性的影响是极其重要的。CMs农药的大量使用，不可避免地造成农药残留暴露于环境中，对生态系统和人类健康造成潜在的风险[4-5]，导致果蔬等农产品长期处在富含CMs农药的环境中，在一定程度上会发生基因突变。基因突变具有不定向性，部分突变可能为抗性突变，从而使细菌对抗生素产生抗性。多项研究表明，CMs农药可以通过嵌插方式作用于DNA，形成DNA加合物，并造成DNA损伤[6-8]。DNA损伤则是导致基因突变发生的常见原因，而基因突变正是产生细菌抗生素抗性的根本途径[9-10]。

抗生素是应用于临床的主要抗感染药物，是一种具有广谱抗菌作用的基础用药，抗生素的种类繁多且其使用量大，环境检出率高，具有强大的抗菌作用，且在正常情况下抗生素不会对宿主本身造成影响，也不会产生严重的副作用[11]。所以人们首先选用抗生素来对抗微生物的感染，近年来，不仅是医疗行业，畜牧养殖业和水产行业及化妆品行业都在大量使用各类抗生素，而大量使用抗生素使环境中遗留了过量抗生素，这些过量的抗生素不仅对水体和土壤造成了一定的污染，也对蔬菜和果树等农作物有直接或间接的影响，对人体健康和生态环境有潜在威胁，会间接地对人类、环境等造成一些不可避免的危害。研究表明：环境中的抗生素抗性可以传递给临床致病菌，从而威胁人类健康，这使得细菌抗生素抗性成为紧迫的环境问题[12-14]。环境污染多呈现复合污染的状态，抗生素和农药常以混合污染物出现，混合污染物总表现出与单一污染物不同的毒性效应，然而目前关于CMs农药和抗生素联合毒性作用的研究还鲜有报道。基于此，本研究从常用的4类CMs农药中分别选取了1种农业生产中使用较广泛的农药作为典型，以食源性致病菌——阴沟肠杆菌为模式细菌，研究不同类型CMs农药和抗生素的单一以及多重毒性效应，通过计算抗性诱导率定量反映CMs农药对细菌抗生素抗性的诱导作用，明确不同类型CMs农药和不同抗生素之间的作用关系，为全面评估环境中CMs农药残留和抗生素残留的生态风险提供新思路和新依据。

1 材料与方法

1.1 材料

甲萘威(萘基氨基甲酸酯类)、抗蚜威(苯基氨基甲酸酯类)、涕灭威(氨基甲酸肟酯类)和异丙威(杂环二甲基氨基甲酸酯类)购自上海市农药研究所有限公司。参考果蔬中最常检出的致病微生物，选取阴沟肠杆菌亚种(Enterobactercloacaesubsp.Cloacae，ATCC 13047)作为受试菌株(简称“Ent菌株”)，购自广东省微生物研究所。试验采用肉汤培养基(NB)对Ent菌株进行活化，NB培养基购自郑州莱浦生物科技有限公司。阴沟肠杆菌菌株测试所用抗生素左氧氟沙星(Lev)、诺氟沙星(Nor)、庆大霉素(Gen)和克拉霉素(Cla)购自北京索莱宝科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 染毒

取Ent冻存菌液10 μL加入30 mL NB营养肉汤，放置摇床上于180 r·min-1、37 ℃恒温活化15 h。将过夜活化后的Ent菌液稀释500倍至含有单一浓度的CMs农药及梯度浓度的抗生素的10 mL NB肉汤中接触染毒，染毒时间根据PPDB数据库中的DT50值，确定于37 ℃下振荡培养48 h。另外设不加农药的相同量菌液做空白对照。

1.2.2 微生物毒性检测

阴沟肠杆菌的毒性检测采用紫外分光光度仪在波长600 nm处测定细菌活性来实现。用NB营养肉汤调零，将染毒菌液和空白对照用NB营养肉汤0.5∶2.5稀释后，分别置于紫外分光光度仪测量吸光度，每组测3次，记录每个梯度的吸光度，根据空白对照组的吸光度计算抑菌率，从而计算抗性诱导率(EOP)。EOP常被用于表征化学药品对微生物非致死复合毒性效应，计算公式[15]：

1.2.3 最小抑制浓度(MIC)值和半致死浓度(EC50)值的测定

根据染毒菌液的抑菌率查得生物统计机率值换算表中抗生素的机率值，再以抗生素浓度的对数值为横坐标、机率值为纵坐标求得回归直线方程。MIC和EC50的机率值分别为5和6.281 6，将MIC和EC50的机率值带入回归方程求得其浓度的对数值，再换算成MIC和EC50的浓度值。

2 结果与分析

2.1 抗生素对阴沟肠杆菌的单一毒性

4种抗生素对阴沟肠杆菌的单一毒性剂量-效应如图1所示。4种抗生素对阴沟肠杆菌的抑制率均随着浓度的增大而增大，最终抑制率趋向100%。本试验所用的Gen、Lev、Cla和Nor的最大浓度分别为4.0、0.5、60.0、1.8 mg·L-1。然后分别设置梯度浓度，测定抗生素浓度对阴沟肠杆菌毒性的作用，测定抗生素对阴沟肠杆菌单一毒性的剂量-效应关系。

由图1可知，Gen在所选定的浓度范围内抑菌率变化幅度最大，Lev和Nor在所选定的浓度范围内抑菌变化幅度较大，而Cla的浓度梯度最大而抑菌率变化幅度最小，在3.75 mg·L-1的浓度下抑菌率就已经达到了近70%。Nor在最大浓度1.8 mg·L-1时抑菌率才刚达到50%。通过计算可得庆大霉素Gen、Lev、Cla和Nor的MIC值分别为1.77、2.39、146.64、31.53 mg·L-1，EC50值分别为0.46、0.10、0.74、1.61 mg·L-1。

图1 抗生素对阴沟肠杆菌的单一毒性剂量-效应曲线

2.2 CMs农药对阴沟肠杆菌的单一毒性作用

确定试验所用抗蚜威(PMC)，甲萘威(CBY)，异丙威(IPC)，涕灭威(ADC)最高浓度分别为1 000、1 000、1 000、800 mg·L-1，然后设置梯度浓度，测定农药浓度对阴沟肠杆菌毒性的作用。农药对阴沟肠杆菌单一毒性的剂量-效应关系如图2所示。4种CMs农药对阴沟肠杆菌的生长都产生了抑制作用，且抑制作用均随着浓度的增大而逐渐增大，即抑制率随着浓度的增大而逐渐升高。PMC对阴沟肠杆菌生长的抑制作用不明显，抑制率随着浓度的增大略有上升，在试验确定的最高浓度1 000 mg·L-1时只有近20%的抑菌率；ADC在最高浓度800 mg·L-1时抑菌率也没有超过50%；CBY相比于其他3种农药其抑菌效果最明显，在0.02 mg·L-1的浓度时就已达到20%的抑菌率。低浓度下，4种CMs农药对阴沟肠杆菌的抑菌率都很低，对阴沟肠杆菌的抑制作用几乎可以忽略不计。

图2 CMs农药对阴沟肠杆菌单一毒性的剂量-效应关系

根据试验所测得的CMs农药对阴沟肠杆菌单一毒性的剂量-效应关系曲线，CMs农药的MIC值远远要大于试验所选用的最高浓度，在本次试验的联合毒性研究中所用的CMs农药浓度都固定在无可观察效应水平(NOEL)。无可观察效应水平定义为对EOP无影响的物质的最高浓度，4种CMs农药对阴沟肠杆菌的抑制率都在10%以内，并且抑制率随浓度的变化趋势较为平缓(表1)。由此认为，CMs农药对阴沟肠杆菌的生长基本没有促进作用和抑制作用。

表1 CMs农药的NOEL和MIC值

2.3 CMs农药和抗生素对阴沟肠杆菌的联合毒性作用

为了确定CMs农药对阴沟肠杆菌抗生素抗性的影响作用，分别测定CMs农药染毒48 h后的阴沟肠杆菌对典型抗生素的抗性变化情况，试验结果如图3所示。

图3 CMs农药对阴沟肠杆菌抗生素抗性的剂量-效应关系

根据抗生素浓度对阴沟肠杆菌的MIC值进行适当浓度的调整，以采用总突变率比值的对数值来表征CMs农药对阴沟肠杆菌抗生素抗性的影响作用。如果联合毒性的对数值大于单一毒性的对数值，说明CMs农药对阴沟肠杆菌抗生素抗性有协同作用；如果联合毒性的对数值小于单一毒性的对数值，说明CMs农药对阴沟肠杆菌抗生素抗性有拮抗作用。

从图3中可以看出，CMs农药结构不同，对阴沟肠杆菌抗生素抗性的影响作用不尽相同，4种CMs农药对阴沟肠杆菌抗生素抗性的剂量-效应关系具有明显的差异性。其中，4种CMs农药都对Lev的抗性增强，表现为协同作用，在浓度小于0.25 mg·L-1时，4种农药对阴沟肠杆菌抗生素抗性的上升程度按大小顺序为甲萘威>抗蚜威>涕灭威>异丙威，说明萘基类CMs农药对Lev的抗性增强效果最为显著。

酯类CMs农药(涕灭威)染毒后阴沟肠杆菌对Nor和Gen的抗性呈下降趋势，但对Nor的抗性变化并不明显，表现为拮抗作用；而对Cla的抗性呈增强趋势，表现为协同作用，且浓度越大，协同作用越显著。萘基类CMs农药(甲萘威)和苯基类CMs农药(抗蚜威)染毒后阴沟肠杆菌对Cla的抗性均随浓度的上升而下降，表现为拮抗作用，浓度越大，拮抗作用越显著；而对Nor的抗性在浓度小于0.9 mg·L-1时抗性增强，表现为协同作用，在浓度大于0.9 mg·L-1后随浓度升高抗性下降，表现为拮抗作用；甲萘威对Gen的抗性表现为协同作用，抗蚜威在浓度小于0.5 mg·L-1时，对Gen的抗性表现为拮抗作用，但拮抗效果并不明显，当浓度大于0.5 mg·L-1时，表现为协同作用，且浓度越大，协同作用越明显。杂环类CMs农药(异丙威)对Cla的拮抗作用略乎其微，对Gen和Nor的抗性表现为协同作用，且对Gen的协同作用随着浓度的升高越来越显著，对Nor的协同作用在浓度为1.8 mg·L-1时最大。因此，在使用甲萘威和抗蚜威时特别需要注意其浓度的合理配制及使用。

3 小结

CMs农药单独作用对阴沟肠杆菌的生长基本没有抑制作用，无显著毒性效应。但CMs农药能改变阴沟肠杆菌的抗生素抗性，不同类型CMs农药对阴沟肠杆菌的抗生素抗性的影响不尽相同。4种CMs农药染毒后阴沟肠杆菌对Lev抗性均表现为协同作用，在浓度小于0.25 mg·L-1时，4种农药对阴沟肠杆菌抗生素抗性的上升程度按大小顺序为甲萘威>抗蚜威>涕灭威>异丙威。酯类CMs农药(涕灭威)染毒后阴沟肠杆菌对Nor和Gen的抗性表现为拮抗作用，萘基类CMs农药(甲萘威)和苯基类CMs农药(抗蚜威)染毒后阴沟肠杆菌对Cla的抗性表现为拮抗作用，而对Nor的抗性在浓度小于0.9 mg·L-1时抗性增强，表现为协同作用，在浓度大于0.9 mg·L-1时表现为拮抗作用。甲萘威对Gen的抗性表现为协同作用；抗蚜威在浓度小于0.5 mg·L-1时，对Gen的抗性表现为拮抗作用，但拮抗效果并不明显，当浓度大于0.5 mg·L-1时，表现为协同作用，且浓度越大，协同作用越明显。杂环类CMs农药(异丙威)对Cla的拮抗作用略乎其微，对Gen和Nor的抗性表现为协同作用。

致病微生物的抗生素耐药性会进一步加重致病微生物对人体健康的威胁。基于本研究的结果，不同浓度的萘基类CMs农药(甲萘威)和苯基类CMs农药(抗蚜威)在田间施用后，对农作物会有不一样的影响作用，所以农作物表面微生物的抗生素抗性问题需要密切关注。本研究结果提示对于农药的施用，除了关注其本身药效、农药残留外，还需考虑其对微生物的影响，这是对人类健康不容忽视的间接危害。对于部分确实会引起致病微生物的抗生素抗性提高的CMs农药，可以进一步探索药效好且对微生物耐药性无影响的替代药物。