乙酰阿魏单硝酸异山梨醇酯对烧伤大鼠皮肤细胞凋亡进程的影响

王 傑，苏福增，刘小龙，姚俊杰，查天建

(新疆维吾尔自治区人民医院，乌鲁木齐 830000)

烧伤是人类生活中最常见的病症之一，每年全球因烧伤致死亡人数已超过30万[1-3]。严重的烧伤患者常因随后发生的并发症和感染导致残疾甚至死亡[4]。由于机械、化学或热损伤导致皮肤屏障功能受损，可导致大量水分流失，从而导致患者血容量不足[5-6]。因此皮肤创面的治疗是烧伤治疗的关键。

皮肤中神经及细胞的坏死是烧伤后机体内最普遍的病理生理现象，同时也是众多并发症发生、发展的重要环节。目前有关烧伤后的消化道黏膜上皮细胞和骨骼肌细胞凋亡机理,和药物对细胞凋亡影响的研究较为深入[7-8]。大量证据表明，烧伤早期即会出现内源性一氧化氮(NO)的降低，这一现象有可能会加剧表皮细胞的损伤[9]。由活性氧和氮氧化合物所形成的抗氧化应激引起内质网应激性和线粒体功能障碍,以及促炎转录因子,也会导致细胞死亡、组织凋亡和器官衰竭[10]。抗氧化酶可能会抑制炎症及高代谢反应[11]。另外给予抗氧化治疗,比如抗坏血酸、谷胱甘肽或与微量元素联合使用可有效减缓烧伤患者皮肤细胞的凋亡过程[12]。具体而言，抗氧化剂可以减弱烧伤皮肤细胞能量的变化，保护微血管循环，减少组织脂质过氧化，从而减缓皮肤细胞的凋亡进程[13]。有相关研究指出，一类新化合物可同时清除NO及ROS从而有效的抑制细胞中的氧化应激作用从而改善细胞凋亡现象，这类药物称为乙酰阿魏单硝酸异山梨醇酯(acetyl ferulaic isosorbide, AFI)[14]。本研究希望通过试验探讨AFI在烧伤后表皮细胞凋亡过程中对于细胞氧化应激的改善作用。

1 材料与方法

1.1 材料30只Wistar雄性大鼠，平均体重(200±20)g，适应环境1 w。由新疆医科大学动物实验中心提供。本实验经新疆维吾尔自治区人民医院伦理委员会批准、审核(审批号KY2018060612)。根据不同的处理，分为假伤组、及时复苏组、及时复苏+AFI药物组、延迟复苏组以及延迟复苏+AFI药物组，每组6只。乙酰阿魏单硝酸异山梨醇酯(AFI)、硫氢化钠(天津福晨化学试剂厂，批号20080520)、冰醋酸(北京化工厂产品，批号20080331)、氯化钠(天津福晨化学试剂厂，批号20081102)、无水乙醇(天津福晨化学试剂厂，批号20081012)；丙二醛(MDA)测试盒(批号20100106)、一氧化氮(NO)测试盒(批号20091118)、一氧化氮合酶分型测试盒(批号20100106)、髓过氧化物酶测试盒(批号20100106)、超氧化物歧化酶(SOD)测试盒(批号20100106)，均购自南京建成生物科技有限公司；Allegra 64Rcentrifage冰冻离心机(美国BECKMAN公司)。

1.2 烧伤小鼠模型的制备及实验方案麻醉后用10%的硫化钠溶液脱除大鼠背部皮毛,脱毛24 h后,根据冯士杰在《大鼠烧伤模型的制作》中的造模工艺:在腹腔注入约20%的乌拉坦5 mL/kg,仰卧位将其四肢用橡皮筋固定在泡沫板上,将暴露的背部皮下完全裸露于泡沫板孔中,随后将泡沫板安置于电热恒压水浴锅中,将暴露的皮下浸渍于约(80±0.5)℃的热水中持续15 s,在烧伤后迅速用方纱揩干水痕,并留下大约30%的深II°度烧伤创面。假伤组水温为37℃。及时复苏组灼伤后及时通过腹腔注射乳酸钠林格氏液40 mL/kg恢复;延迟复苏组于灼伤后6 h给予通过腹腔注射乳酸钠林格氏液40 mL/kg恢复;及时复苏+AFI药物组灼伤后即刻给予腹腔注射乳酸钠林格氏液40 mL/kg恢复同时给予AFI 10 mg/kg;延迟复苏+AFI药物组灼伤后6 h立即给予腹腔注射乳酸钠林格氏液40 mL/kg恢复同时给予AFI10 mg/kg。各组小鼠均于伤后12 h内腹腔注射20%的乌拉坦5 mL/kg麻醉治疗后,经腹主动脉取血离心分离取新鲜血清,将小鼠血清和余下的烧伤皮肤组织取出后,立即放入-70℃的冰箱中储存待检。

1.3 血清及烧伤皮肤中SOD、MDA、NO、NO合酶含量检测用对应的丙二醛测试盒、一氧化氮测试盒、一氧化氮合酶分型测试盒、髓过氧化物酶测试盒、超氧化物歧化酶测试盒，分别按说明书加试剂及标本进行检测。

2 结果

2.1 各组大鼠血清、皮肤SOD活性变化假伤组大鼠血清、皮肤SOD活性均高于烧伤各组大鼠(P<0.05)；使用AFI药物的及时复苏组大鼠与延迟复苏组大鼠血清、皮肤SOD活性均高于未使用AFI药物组大鼠(P<0.05)，见表1。

表1 各组大鼠烧伤后血清、皮肤SOD活性变化

2.2 各组大鼠血清、皮肤MDA水平变化烧伤各组大鼠血清、皮肤MDA水平相比于假伤组均显著增加(P<0.05)；进行复苏处理的大鼠中,使用AFI治疗干预的大鼠血清、皮肤MDA水平与未使用AFI治疗的大鼠相比显著降低,差异均有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 各组大鼠烧伤后血清、皮肤MDA水平变化

2.3 各组大鼠血清、皮肤NO及NO合酶变化烧伤各组大鼠血清、皮肤NO和NO合酶含量相比于假伤组均显著增加(P<0.05)；进行复苏处理的大鼠中,使用AFI治疗干预的大鼠血清、皮肤NO和NO合酶含量与未使用AFI治疗的大鼠相比显著降低,差异均有统计学意义(P<0.05)，见表3、4。

表3 各组大鼠烧伤后血清、皮肤NO的变化

表4 各组大鼠烧伤后血清、皮肤NO合酶的变化

3 讨论

本研究结果表明，乙酰阿魏单硝酸异山梨醇酯(acetyl ferulaic isosorbide, AFI)这类抗氧化药物在烧伤大鼠实验中可有效的增强烧伤皮肤细胞的抗氧化作用，从而减缓受损的皮肤细胞凋亡。

研究表明[15]，在烧伤患者中，创面剩余上皮细胞决定了烧伤修复的方式方法和愈合时间，如何能够快速修复创面，恢复皮肤屏障是治愈烧伤的关键环节，深Ⅱ°烧伤创面残存上皮的转归直接关系到烧伤患者的愈合周期和手术次数，如果能够减少残存上皮细胞凋亡，可大大减少患者植皮面积，降低治疗经费缩短治疗周期。另外烧伤受损的皮肤细胞多处于炎症状态，而炎症状态的皮肤细胞会导致机体的高代谢表现，大面积烧伤患者的炎症特征会增加机体的分解代谢反应从而导致多器官功能障碍甚至导致患者死亡。更多的学者希望通过探索减少受损皮肤细胞炎症的不同途径来解决这一问题，例如使用抗氧化剂治疗[15-16]。本研究中AFI药物展现出的抗氧化作用能够较好地抑制烧伤受损的皮肤细胞的凋亡进程，证明了抗氧化剂对烧伤皮肤治疗的正面作用，但本研究对于实验动物烧伤炎症状态的监测并不完善。

在细胞水平，抗氧化剂有减少活性氧产生以及阻断或减弱转录因子的合成，减少炎症标志物中重要蛋白质的产生，从而减轻炎症的作用[17]。而烧伤中进行性的皮肤组织损伤常常伴随着异常高水平的MDA的产生[18]，本研究中烧伤各组大鼠的皮肤MDA检测水平与该结论相符。而抗氧化剂是中和活性氧并可能减少损伤的一种有效方法[19-20]，实验中使用抗氧化剂AFI的大鼠血清及皮肤检测出MDA均较未使用组大鼠有所降低。AFI的研究学者在动物实验中应用心肌抗氧化研究也获得了一定的疗效,本研究将该物质运用于烧伤动物皮肤的抗氧化研究中也发现了同样的抗氧化效应,能够降低过氧化应激反应并且降低上皮细胞的凋亡。现阶段尚无大型的前瞻性临床试验或队列研究来有效的证明抗氧化剂对烧伤患者皮肤细胞凋亡及炎症进程中有明显的阻断效果[21]。而抗氧化剂能够补充谷氨酰胺从而提高烧伤患者的生存率这一结论已被证明[22]。本研究中使用AFI这一抗氧化剂作为主要治疗措施，对实验大鼠的相关检测一定程度验证了抗氧化剂对烧伤细胞凋亡的阻断作用，但缺乏对大鼠炎症进程及烧伤后生存率的研究，需在后续研究中完善及验证。

有关对严重烧伤的患者进行抗氧化剂补充治疗的研究表明，这一治疗可以有效缩短平均住院时长，提高创面皮肤愈合率的同时还能够降低患者的总体死亡率[23]。对于早期阶段的烧伤患者而言，能够有效抑制皮肤细胞凋亡过程是十分重要的，因此需要更大规模的相关研究来提供证据，来进一步阐述使用抗氧化剂降低细胞凋亡的具体进程。AFI药物使细胞因子减少将会导致可的松和儿茶酚胺总体水平降低，胰高血糖素和胰岛素的产生减少，进而减少细胞高代谢，减缓细胞凋亡进程[21,24]。

综上所述，新化合物乙酰阿魏单硝酸异山梨醇酯(AFI)能够有效的促进实验大鼠烧伤皮肤细胞的抗氧化作用，从而抑制细胞的凋亡进程，即提高实验大鼠血清及皮肤中抗氧化酶(SOD)的浓度，降低实验大鼠血清及皮肤中NO、MDA及NO合酶水平。本研究为有效的抑制烧伤患者皮肤细胞凋亡，进而更有效的救治烧伤患者提供了新的思路，但未能进一步研究其化合物的确切药理学机制及大鼠体内的作用靶点，将是下一步研究探讨的方向。