大黄干预对慢性肾功能衰竭大鼠模型肠道上皮细胞Claudin-1、Occludin和ZO-1表达的影响

宋维维，刘 晓，李 悦，舒占钧

(新疆医科大学 1第四临床医学院，2附属中医医院，乌鲁木齐830000)

慢性肾功能衰竭(CRF)是由于慢性肾病和相关代谢障碍所引起肾小球滤过率(GFR)的衰退从而不能维持肾脏基本功能的临床疾病。全球有超过8.5亿人患有肾病[1]。依据近年来糖尿病及心血管病的患病率上升的趋势，慢性肾脏病(CKD)患者的人数预计将会增加。一旦疾病发展到终末期肾病(ESRD)，死亡率可能是肾功能正常人群的10～100倍[2]。CRF从第一阶段到第五阶段的发展过程中，目前临床上使用的干预手段很少，主要是使用血管紧张素受体拮抗剂及血管紧张素II转换酶抑制剂来降低三高的情况，同时强调进行低蛋白质的摄取，这些主要降低了氮代谢物的摄取，也有诸如AST-120活性炭这样的口服吸附剂[3]。但是病情发展到第五阶段，就需要血液透析、腹膜透析、肾脏移植等治疗手段[4]。现代研究证实大黄可以有效抑制蛋白质的氧化分解，增加氮质毒素的及时排出，并借助诱导钠离子的泵出而改善肠内的营养状态，促进肠道蠕动加快，随即充分发挥泄下清肠的功效[5]。另外，大黄可以促进代谢废物如肌酐、肠源性毒素硫酸吲哚酚从肠道的排泄[6]，通过降低D-乳酸和内毒素，上调肠黏膜上皮闭合蛋白的表达，增强肠道绒毛吸收和分泌能力[7]。随着对慢性肾功能衰竭研究的深入，发现慢性肾衰竭可引起肠上皮细胞的机械屏障功能及紧密连接(Tight junction,TJ)结构损害，而上皮细胞自身的极性与细胞间的黏附性的一个重要体现就在相邻细胞之间形成的紧密连接，紧密连接蛋白的高浓度表达是上述功能的基础。连接蛋白-1(Claudin-1)、闭合蛋白(Occludin)和闭锁小带蛋白-1(ZO-1)作为经典紧密连接蛋白，目前鲜有对大黄是否可通过调控紧密连接蛋白影响肾脏病变的研究。因此，本研究拟通过大黄干预对慢性肾功能衰竭大鼠模型肠道上皮细胞Claudin-1、Occludin和ZO-1表达的影响进行探讨，为找寻治疗慢性肾功能衰竭的有效方法提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 仪器酶标仪(Bio-Rad,xMarkTM)；微量移液器(大龙医疗设备有限公司,单道移液器、多道移液器)；电热恒温水槽(上海精宏试验设备有限公司，DK-80)；Real Time PCR instrument(ABI，ABI QuantStudioTM6 Flex Real-Time PCR Syste)；PCR仪(Bio-Rad，USA，MyCycler Thermal Cycler)。

1.2 试剂Anti-Occludin抗体(abcam公司，ab216327)；PVDF Transfer Membrane(Sangon Biotech，G0167-500 g)；RIPA裂解液(博士德，AR0105)；尿素氮试剂盒(南京建成，C013-2)；肌酐(CRE)测定试剂盒(南京建成，C011-2)；氯仿(天津市福宇精细化工有限公司，XK13-011-00015)；Trans2K DNA Marker(全式金，BM101)；TransZol Up(全式金，ET111)；TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix(全式金，AT311)；QuantiNava SYBR Green Kit(凯捷，208054)。

1.3 实验动物SPF级SD雄性大鼠[新疆医科大学实验动物中心动物生产许可证号：SYXK(新)2008-2003]，6周龄，体重(200±20)g，适应性喂养7 d，饲养于新疆医科大学实验动物中心，室温(20±2)℃、相对湿度(55±5)%，光照明暗交替12 h/12 h。

1.4 实验药物大黄：常规煎煮过滤，浓缩100%(每mL含生药1 g)的药液。中药由新疆医科大学附属中医医院药剂科提供，并统一煎煮。青霉素：石药集团中诺药业，80万U/支(国药准字H13021634)。肾康宁胶囊：江西普正制药有限公司，0.35 g*12粒*5板(国药准字Z20090221)。

1.5 模型的建立60只SD雄性大鼠随机分为空白对照组(不做干预，给予生理盐水1.35 μL·g-1·d-1灌肠)、阳性对照组(切除左肾2/3及右肾，给予肾康宁水溶液1.35 μL·g-1·d-1灌肠)、手术组(切除左肾2/3及右肾，给予生理盐水1.35 μL·g-1·d-1灌肠)、手术灌肠组(切除左肾2/3及右肾，给予100%浓度的大黄药液1.35 μL·g-1·d-1灌肠)、假手术组(肾囊剥离，给予生理盐水1.35 μL·g-1·d-1灌肠)、假手术灌肠组(肾囊剥离，给予100%浓度的大黄药液1.35 μL·g-1·d-1灌肠)，每组10只，生存环境完全相同。手术组均行左肾2/3及右肾切除术，手术方法参照文献[8]：在大鼠下腹部腹中线两侧0.5 cm处注射戊巴比妥钠进行麻醉，麻醉后将大鼠固定在鼠台上。在脊椎两侧将附近的被毛用剪刀或者电动剃刀剃干净，充分暴露肾脏所在部位的表皮，用碘伏对皮肤进行消毒，戴上无菌手套，并用无菌洞巾覆盖未剃毛的部位。沿着肋脊角斜向左背部进行手术，切口1.5～2.0 cm，切开皮肤和里层肌肉黏膜，用左手食指或钝口钳将左肾部位切口打开，使左肾完全露出，并将肾包膜切开剥除，结扎左肾上极区(7号线)，结扎部位选择约2/3的肾皮层，将结扎的位置切下移除，并立即用明胶止血海绵压迫剩余的肾脏进行止血，在完全没有出血的情况下，将其复位，并进行分层缝合消毒。腹腔注射青霉素7.2万U/d，持续3 d。1周后行右肾切除，并在右脊椎上做斜形切口，进行肌层剥离，肾口结扎后将右肾摘除，分层缝合，消毒。腹腔注射青霉素7.2万U/d，共3 d。假手术组手术过程与手术组一样，但只需麻醉、肾囊剥离和暴露，双肾不切除。

1.6 指标检测及方法

1.6.1 总体状况和体重的变化情况 每天对大鼠进行医学观察，包括精神状态、活跃程度、被毛、排便、饮食习惯等；每天对灌肠两组进行称重，每周对各组进行称重。记录死亡情况及病情发展。

1.6.2 血清肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)检测 采血前禁食不禁水，于1、2、4周时采血1.5 mL，5周时处死所有大鼠，离心机转速3 000r/min，离心10 min，见管内分为3层，第1层淡黄色为血清，第2层为血小板，第3层为血浆，移液枪吸出上层淡黄色液体，转放在另一EP管中，放置于-80℃冰箱保存待测。采用全自动生化分析仪及配套试剂盒检测血肌酐、尿素氮水平。

1.6.3 组织苏木精-伊红(HE)染色 用4%甲醛固定肾脏和结肠组织，梯度乙醇脱水，透明，石蜡包埋，中性树胶封固，切片，用苏木精-伊红染色，于光学显微镜下拍照(×100)，用于组织形态学观察。

1.6.4 实时荧光定量PCR法检测Claudin-1、Occludin和ZO-1的mRNA表达 将结肠组织放入冷冻管中，放入液氮中迅速冻存后保存在-80℃冰箱中，于实时荧光定量PCR检测。参考Trizol试剂说明书提取升结肠、降结肠的总RNA，测定RNA的浓度和纯度，然后将RNA反转录为cDNA，再以cDNA作为模板进行PCR扩增，反应条件：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，60 ℃退火30 s，68 ℃延伸20 s，共40个循环。每个样品重复3个复孔，用△△Ct法分析数据。以β-actin作为内参，引物序列如下：(1)Claudin-1上游引物：5′ATGGCAATAGAATCGTT3′，下游引物：5′TTGGTGTTGGGTAAGAG3′；(2)Occludin上游引物：5′AATAAAGAACTCTCCCG3′，下游引物：5′CATAGTCTCCAACCATC3′；(3)ZO-1上游引物：5′TGGTGTCCTACCTAATTCAACTCA3′，下游引物：5′CGCCAGCTACAAATATTCCAACA3′；(4)β-actin上游引物：5′ACTCTTCCAGCCTTCCTTCC3，下游引物：5′GAGGAGCAATGATCTTGAT。

1.6.5 Western blot法检测Claudin-1、Occludin和ZO-1的蛋白表达 用冷冻研磨机研磨组织，按试剂盒说明操作提取组织细胞核蛋白，经10%SDS-PAGE凝胶电泳后转膜，洗膜，以5%脱脂奶粉室温封闭1 h，加入相应一抗β-actin(1∶1 000)、Claudin(1∶500)、Occludin(1∶500)、ZO-1(1∶500)4 ℃孵育过夜，再次洗膜后加入HRP标记的二抗，室温孵育膜2 h，洗膜后将显色液滴加在 PVDF膜上，曝光成像。

2 结果

2.1 各组大鼠一般情况的变化

2.1.1 手术组 精神状态极度萎靡不振，毛皮颜色干枯晦暗，眼睑结膜苍白，出现脱毛象，弓背蜷缩，反应迟钝缓慢，活动变少，进食量比阳性对照组减少，体重无显性变化，垫料气味臭秽，便质较空白对照组稀溏。

2.1.2 手术灌肠组 精神状态日益好转，毛皮部分有光泽，进食量及饮水量均增加，反应较手术组灵敏，垫料气味由臭秽逐日好转变淡，便质由稀溏逐渐转为颗粒状且排便习惯恢复较快。

2.1.3 假手术组 精神状态萎靡，毛皮较阳性对照组颜色黯淡，眼睑结膜较红润，活动较阳性对照组减缓，反应一般，每日进食量及饮水量正常，垫料气味较淡，大鼠便质由较稀溏转为正常。

2.1.4 假手术灌肠组 精神状态轻度萎靡，毛皮部分轻度有光泽，进食量及饮水量比阳性对照组增加，反应一般，垫料气味较淡，大鼠便质由稀溏转为颗粒状。

2.1.5 阳性对照组 精神状态良好，毛皮部分有光泽，进食量及饮水量渐增，反应灵敏，垫料气味好转变淡，便质由稀溏较快转为颗粒状。

2.1.6 空白对照组 精神状态良好，毛皮有光泽，眼睑结膜红润，无脱毛现象，活动正常，反应灵活，生性好动，每日进食量及饮水量均正常，体重增加明显，垫料气味淡，大鼠便质如常，排便未见异常。

2.2 各组大鼠体重的变化与空白对照组比较，手术组大鼠体重下降明显，差异有统计学意义(P<0.05)；与手术组比较，手术灌肠组大鼠体重上升，差异有统计学意义(P<0.05)；手术灌肠组和假手术灌肠组大鼠体重与空白对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 各组大鼠体重的变化

2.3 各组大鼠血清中BUN水平的变化与假手术组比较，手术组大鼠BUN水平升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与假手术灌肠组比较，手术灌肠组大鼠BUN水平下降，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 各组大鼠血清中尿素氮(BUN)水平比较

2.4 各组大鼠血清肌酐(Scr)水平的变化与假手术组比较，手术组大鼠血清Scr水平升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与假手术灌肠组比较，手术灌肠组大鼠血清Scr水平下降，差异有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表3 各组大鼠血清肌酐(Scr)水平比较

2.5 各组大鼠肾脏组织染色结果空白对照组、假手术组及假手术灌肠组大鼠肾脏组织细胞形态未见异常；与空白对照组比较，手术组大鼠肾脏组织细胞出现间隙明显增宽、细胞明显纤维化，部分组织伴有炎性细胞浸润，并可见出血灶；与手术组比较，阳性对照组和手术灌肠组大鼠肾小球体积缩小程度减轻，近曲小管上皮萎缩减轻，出血灶减少，呈现出不同程度的改善，见图1。

注：A，手术组；B，手术灌肠组；C，假手术组；D，假手术灌肠组；E，阳性对照组；F，空白对照组。

2.6 各组大鼠结肠组织Claudin-1、Occludin和ZO-1的mRNA表达水平的变化与阳性对照组比较，手术组Claudin-1、Occludin和ZO-1的mRNA表达显著减少，差异有统计学意义(P<0.05)；与阳性对照组相比，手术灌肠组Claudin-1、Occludin和ZO-1的mRNA表达增加，差异有统计学意义(P<0.05)；与假手术组比较，手术组Claudin-1、Occludin和ZO-1的mRNA表达减少，差异有统计学意义(P<0.05)；与假手术组比较，手术灌肠组Claudin-1、Occludin和ZO-1的mRNA表达增加，差异有统计学意义(P<0.05)；与手术组比较，手术灌肠组和假手术灌肠组Claudin-1、Occludin和ZO-1的mRNA表达增加，差异有统计学意义(P<0.05)，见表4。

表4 RT-PCR实验基因mRNA相对表达量比较

2.7 各组大鼠结肠组织Claudin-1、Occludin和ZO-1的蛋白表达水平的变化与阳性对照组比较，手术组Claudin-1、Occludin和ZO-1的蛋白表达减少，手术灌肠组Claudin-1、Occludin和ZO-1的蛋白表达增加，差异均有统计学意义(P<0.05)；与假手术组比较，手术组Claudin-1、Occludin和ZO-1蛋白表达减少，手术灌肠组Claudin-1、Occludin和ZO-1蛋白表达增加，差异有统计学意义(P<0.05)；与手术组比较，手术灌肠组和假手术灌肠组Claudin-1、Occludin和ZO-1蛋白表达增加，差异有统计学意义(P<0.05)；与假手术灌肠组比较，手术灌肠组Claudin-1、Occludin和ZO-1蛋白表达增加，差异有统计学意义(P<0.05)，见表5。

表5 各组大鼠Claudin-1、Occludin和ZO-1的蛋白相对表达水平

3 讨论

CRF是原发性肾病和继发性肾病病变发展到一定程度而造成的多器官功能损害的结果，电解质失衡、酸碱平衡紊乱、代谢废物潴留及多脏器的损害是主要的临床表现[9]。CRF患者在病情的发展中会产生肠道生态系统的紊乱，主要是产生尿毒素的条件致病菌数量的增加，结果造成了肠道内毒素在血液中堆积，不能被损害的肾脏及时排出，导致肾脏的排泄功能进一步减退，最终，在肠、肾之间形成了一个无法改善的恶性循环[10]。有多项临床实验和动物实验研究证明，大黄能减轻肾脏的高代谢状态，增加血清中肠源性尿毒素的排泄，减缓肾间质纤维化速度，降低异常脂质代谢，抑制细胞外基质合成和提高肾间质耐氧能力等改善肾功能[11]。本实验研究结果表明，CRF大鼠用大黄治疗后一般情况好转，体重呈上升趋势，血清BUN、Scr呈下降趋势，肾脏和结肠组织细胞排列相对有序、细胞纤维化减少，出血灶减少变小。表明大黄经肠道干预可以有效减缓慢性肾功能衰竭大鼠模型肾脏病理损伤，并改善残余肾脏功能。

肠上皮细胞作为肠屏障系统的主要组成部分，在保持内环境稳定平衡方面发挥着重要作用[12]。在机体处于正常的状态下，它能防止有害的物质和潜在的病原体进入机体，同时可以使离子、水和营养物质进入机体，维持机体的正常新陈代谢，保证肾脏的正常功能[13]。Claudin-1、Occludin和ZO-1作为肠上皮细胞紧密连接的核心蛋白，对外环境中病原体或有害物质侵入肠屏障损害肠道起到了至关重要的保护作用[14]。紧密连接蛋白可改善肠道屏障，从而减少肠道菌群和肠道毒素向肠道黏膜的易位和肠道炎症，最终减少肾间质纤维化，从而延缓CRF的发展[15]。Occludin蛋白可以增加成纤维细胞之间的黏附性，增加跨膜电阻，维持细胞之间的通透性在正常范围内，保持肠上皮细胞和紧密连接结构的保护作用[16]。Claudin蛋白可以聚合成线状原纤维(构成纤维的前体物质)，是形成紧密连接原纤维的主要成分，调节肠道上皮细胞的物质转运，对TJ结构起支柱作用，这类蛋白高表达导致上皮细胞更加紧密。ZO-1的N末端可直接与Ot-连锁蛋白(cate-nin)或细胞质E-钙黏连素结合(但不能与 B-连锁蛋白合)，这表明ZO-1在不同的细胞之间形成了一种与肌动蛋白细胞骨架的联系方式[17]，对紧密连接的开启和闭合起到介导作用[18]。本实验结果表明，CRF大鼠用大黄治疗后可以增加Claudin-1、Occludin和ZO-1的mRNA及蛋白表达，进而可以改善肠道屏障的受损，减轻肠屏障的清除量，肠道内的细菌和分解产物可以正常排出，并可以抵抗肠腔内有害物质的侵袭，减轻对肠道本身的损伤，进而减轻残余肾脏的高负荷，延缓慢性肾功能衰竭的进展。

综上所述，大黄能提高SD大鼠模型中Claudin-1、Occludin和ZO-1的mRNA及蛋白的表达，明显减轻肾脏组织损伤。但干预过程中还有许多细节和具体靶点尚不清楚，故需进一步探索研究。