四种中药单体联合亚胺培南对耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌体外抑菌作用研究

唐金蓉，张 碟，李 盛（成都中医药大学附属绵阳医院检验科，四川绵阳 621000）

肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae，KP) 是医院和社区感染性疾病的常见病原菌。随着广谱抗生素的广泛应用，耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌(carbapenem-resistantKlebsiella pneumoniae, CRKP)的检出率逐年增加，全国细菌耐药监测网报告显示，我国CRKP检出率从2014年的6.4%上升至2019年的10.9%[1]。CRKP感染常发生于重症患者，即使采用碳青霉烯类抗生素、多黏菌素或替加环素为基础的联合用药方案，死亡率仍高达30%以上[2]。新药头孢他啶/阿维巴坦虽对CRKP有良好的活性，但对产金属酶的CRKP无效[3]。随着对中药研究的深入，发现中药同抗生素联用,不仅有增敏作用，还能起到减毒的效果，中药联合抗生素或许是解决CRKP感染的新方法[4]。目前已有研究表明部分中药汤剂或注射液联合亚胺培南（imipenem，IMP）对CRKP具有协同作用[5-6]，但对中药单体的研究较少。本研究将通过体外联合药敏试验，研究中药单体联合IMP对CRKP的抑菌作用，为CRKP的中西医联合治疗提供思路。

1 材料与方法

1.1 研究对象 6株CRKP为成都中医药大学附属绵阳医院2021年1～6月从住院患者静脉血、胸腹腔积液、尿液、合格痰液等分离出的非重复菌株。参照美国临床实验室标准化协会(the Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)2020年标准[7]：IMP和/或美罗培南MIC≥4μg/ml的菌株纳入试验。6株CRKP均为仅对复方新诺明敏感的泛耐药菌株。本研究经我院伦理委员会审批通过。

1.2 仪器与试剂 鉴定药敏仪为法国梅里埃VITEK2 Compact。质控菌株来自温州康泰，主要为霍氏肠杆菌ATCC 700203，嗜麦芽窄食假单胞菌ATCC17666等。中药单体标准品小檗碱（批号924L022）、穿心莲内酯（批号821B021）、黄芩苷（批号419J021）、栀子苷（批号125D022）和IMP（批号230B031）均来自北京索莱宝科技有限公司，经高效液相色谱证实其纯度均大于98%。二甲亚枫(Dimethyl sulfoxide, DMSO)（批号 1121E0327）来自北京索莱宝科技有限公司，纯度大于99.9%。

1.3 方法

1.3.1 药液的制备：小檗碱、穿心莲内酯和黄芩苷用DMSO溶解，栀子苷用无菌水溶解，四种中药单体的贮存液浓度和初始浓度均为该药的最低溶解浓度，为10 000μg/ml。IMP干粉用0.01mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.2）溶解，贮存液浓度为5 120μg/ml，使用时用MH肉汤稀释至试验初始浓度512μg/ml。DMSO的初始浓度为100%。

1.3.2 菌液的制备：挑取单个菌落至专用细菌稀释液中，用比浊仪将菌液浓度调至0.5麦氏单位(细菌浓度为1×108CFU/ml)，然后稀释100倍，即得到细菌浓度为1×106CFU/ml的菌液备用。

1.3.3 测定小檗碱、穿心莲内酯、黄芩苷、栀子苷、IMP和DMSO对CRKP的最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)：以小檗碱为例，使用96孔培养板进行微量肉汤稀释法，小檗碱起始浓度为10 000μg/ml，进行倍比稀释，使小檗碱药液调节为20～10 000μg/ml的10个浓度梯度,每孔100μl。第11孔、12孔分别为阳性对照和阴性对照。第1到第10孔分别加入100μl菌液，每孔细菌的终末浓度为5×105cfu/ml。35℃孵育16～24 h读取MIC值。

1.3.4 测小檗碱、穿心莲内酯、黄芩苷和栀子苷分别联合IMP对CRKP的MIC计算分级抑菌浓度(fractional inhibitory concentration，FIC)指数：采用微量肉汤稀释棋盘法进行药敏实验：以小檗碱为例，将小檗碱 和IMP的贮存液分别从2倍MIC值开始用MH肉汤稀释8个稀释倍数备用，96孔板的行和列分别按浓度从大到小加小檗碱和IMP药液，每孔50μl；再每孔加入100μl菌液；每行的最后两孔分别作为阴性对照和阳性对照。35℃孵育16～24 h读取MIC值。

1.3.5 FIC计算方法和结果解读：FIC=MIC甲药（联合）/MIC甲药（单测）+MIC乙药（联合）/MIC乙药（单测）。FIC≤0.5,则表示两种药物之间具有协同作用；0.5＜FIC≤1，则表示两种药物之间具有相加作用；1＜FIC≤2，表示无关作用；FIC>2，表示存在拮抗作用。

1.4 统计学分析 应用SPSS21.0统计软件进行数据分析。计数资料以例数（n）表示，药物MIC均值以中位数表示，药物联合前后MIC的比较采用两独立样本的Wilcoxon秩和检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小檗碱、穿心莲内酯、黄芩苷、栀子苷、IMP和DMSO对6株CRKP的MIC 小檗碱和穿心莲内酯对CRKP的MIC均为2 500μg/ml，黄芩苷为5 000～10 000μg/ml，栀子苷均＞10 000μg/ml，IMP为16～64μg/ml，DMSO均>100%。

2.2 小檗碱、穿心莲内酯、黄芩苷、栀子苷分别联合IMP对6株CRKP的MIC,并计算FIC 见表1。棋盘法结果显示小檗碱联合IMP对CRKP的FIC为0.625～0.75，表现为相加作用(6株）；穿心莲内酯联合IMP对CRKP的FIC为0.625～1.25，表现为相加作用（5株）和无关作用（1株）；黄芩苷联合IMP对CRKP的FIC为0.375～0.75,表现为协同作用（3株）和相加作用（3株）；栀子苷联合IMP对CRKP的FIC均为1.125，表现为无关作用（6株）。

表1 四种中药单体分别联合IMP对CRKP的MIC（μg/ml）和FIC

2.3 小檗碱、穿心莲内酯、黄芩苷和栀子苷分别联合IMP后MIC的变化 见表2。四种中药单体联合IMP后其MIC均降低，差异具有统计学意义（Z=-3.317～-3.108，均P＜0.05）。黄芩苷联合IMP后可降低IMP的MIC，差异有统计学意义（Z=-2.459，P＜0.05），小檗碱、穿心莲内酯和栀子苷联合IMP后IMP的MIC变化差异无统计学意义（Z=-1.950～0.000，均P＞0.05）。

表2 四种中药单体分别联合IMP前后MIC（μg/ml）变化

3 讨论

耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌 (CRKP)的耐药性与患者的死亡率显著相关，且其耐药性在全球仍然呈上升的趋势，对公共卫生造成了极大的威胁[8-9]。临床对于有效治疗CRKP感染的药物需求亦迫在眉睫，然而，新的抗生素开发需要巨大的经济投入、先进的技术支持以及长期的效果评估[10]，难以满足临床迫切的需求。近年来随着对中药成分的分离、提取工艺不断提升以及中药的抑菌机制研究深入，发现中药能通过影响细菌生物膜通透性直接杀菌、抑制蛋白质和核酸的合成，从而干扰细菌的代谢过程、抑制细菌代谢过程所需酶活性等方式进行抗菌[11]，中药材已经成为研制新型抗生素的重点对象。本研究从成分明确的中药单体入手，研究其与抗生素联合用药的体外效果，探索对CRKP的治疗新方法。

通过测定四种中药单体对CRKP的MIC发现，小檗碱、穿心莲内酯和黄芩苷对CRKP具有抑菌作用，但其MIC值均较高，远远高于抗生素的MIC，这种浓度在体内很难达到，单独使用很难实现体内抗菌的效果。大多数中药单体都要较高的浓度才能有直接抑菌作用，故中药单体更多被用做抗菌增效剂使用[12]。

进一步通过棋盘法测定四种中药单体分别联合IMP的联合药敏试验发现，小檗碱、穿心莲内酯、栀子苷与IMP联用后表现为相加作用或无关作用，且不能降低IMP的MIC，但干铁儿等[13]研究发现在体外药敏实验中，黄连素（小檗碱）联合亚胺培南西司他丁对CRKP具有协同作用和相加作用，暴露72h还可以降低CRKP对亚胺培南-西司他丁的耐药性，这有待进一步研究。本研究发现黄芩苷与IMP联合部分具有协同作用，并且联用后可降低IMP对CRKP的MIC，提示黄芩苷对IMP具有增效作用。黄芩苷是从黄芩的干燥根中提取而来的黄酮类化合物，是中药黄芩的主要抑菌成分，也是黄芩中含量最丰富的化合物，具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化等多种药理作用[14]。生物被膜的形成是CRKP的主要耐药机制之一[15]，韩佳慧等[16]研究发现当黄芩苷达到一定浓度时，可以进入生物被膜内，从而延缓CRKP的生长，同时抑制生物被膜的形成，从而达到抑菌以及对抗生素的增敏作用。SHI等[17]通过分子对接发现黄芩苷中的羧基可以与金属酶活性中心的Zn2+相互作用，对CRKP的金属酶产生抑制作用，从而恢复对部分抗生素的敏感性。因此黄芩苷可能是通过清除生物被膜、抑制多重耐药酶等方式降低CRKP对IMP的耐药性。虽然黄芩苷对IMP具有增敏作用，但还不足以逆转CRKP对IMP的耐药，还需要进一步通过基因修饰等方法提高其增敏作用。

本研究中的四种中药单体相关的中药均不属于2020版中国药典收录的毒性中药[18]，故具有较高的安全性。不足之处在于本次试验为体外药敏试验，与体内实际疗效之间可能存在部分差异，作用机制有待进一步证实。同时，由于是单中心研究，样本量较小，可能影响实验结果，有待更多数据验证。

综上所述，小檗碱、穿心莲内酯、黄芩苷和栀子苷这四种中药单体中，小檗碱、穿心莲内酯和黄芩苷对CRKP具有抑菌作用，黄芩苷同IMP联合对CRKP具有协同作用，且与IMP联用能降低CRKP对IMP的耐药性，具有增敏作用。