胰腺癌组织CTTN和miR-545-3p表达水平及其与临床病理和预后的相关性研究

张莉娜，张霁雯，罗 酩，赵苏鸣

（1.上海市宝山区罗店医院消化内科，上海 201900；2.南通大学附属医院消化内科，江苏南通 226001）

尽管现代医疗技术飞速发展，许多癌症的生存率显著提高，但胰腺癌仍然是一种致死率高的消化道肿瘤，早期发现困难[1]。目前，无论是美国、欧洲、日本还是中国，全球胰腺癌的发病率和死亡率都在逐渐升高[2]。在全球范围内，预计到2050年胰腺癌发病率将增加到8.1/10万例，年均增长1.1%，这意味着胰腺癌将构成重大的公共卫生负担[3]。由于胰腺的解剖位置相对较为特殊，胰腺癌的发展通常在晚期才被诊断出来，临床症状明显[4]。因此，寻找新的胰腺癌相关的生物学标志物对于早期诊断和治疗胰腺癌具有重要的临床意义。癌细胞的转移进展需要肌动蛋白细胞骨架的重塑，肌动蛋白细胞骨架的关键调节蛋白皮层肌动蛋白（cortical actin，CTTN）表达的改变有助于致癌作用[5]。据报道，通过GEPIA2平台分析胰腺癌组织中CTTN mRNA表达水平显著增加。多项研究证明，miRNA在肿瘤中发挥促癌或抑癌作用[6]。研究显示，miR-545-3p在非小细胞肺癌中显著低表达，参与调控肿瘤细胞的增殖和转移[7]。关于miR-545-3p在胰腺癌中的相关报道较少，且CTTN mRNA与miR-545-3p之间是否具有相互作用仍不明晰。本研究通过对胰腺癌组织中CTTN mRNA和miR-545-3p的表达进行检测，并进一步分析二者在临床上发挥的功能。

1 材料与方法

1.1 研究对象 募集南通大学附属医院2016年1月～2018年12月收治的胰腺癌患者138例，其中男性82例，女性56例，年龄42～67（62.18±4.28）岁。纳入标准：①通过腹腔镜胰腺癌切除手术，经病理分析确诊为胰腺癌；②在术前并未接受任何形式的抗肿瘤治疗；③参与者资料完整。剔除标准：①不符合手术指征，如发生远处转移；②并发其他恶性肿瘤；③随访过程中失去联系。胰腺癌患者中，76例患者存在慢性胰腺炎病史，74例存在新发糖尿病（无糖尿病病史，首次确诊）。按照发病部位来区分：93例胰头癌，45例胰体尾部癌；按照病例的类型来区分：123例导管腺癌，15例其他（8例黏液性囊腺癌、5例腺泡细胞癌和2例腺鳞癌）；按照肿瘤直径来区分：80例肿瘤直径≥4 cm，58例肿瘤直径＜4 cm；按照分化程度来区分：98例低中分化程度，40例高分化程度；按照TNM分期来区分：48例Ⅰ～Ⅱ期，90例Ⅲ期；按照是否存在淋巴结转移来区分：41例存在淋巴结转移，97例不存在淋巴结转移。本研究均获得医院伦理委员会批准和患者的知情同意书。

1.2 仪器与试剂 Trizol试剂（美国Invitrogen）；逆转录酶（德国Roche）；SYBR Green试剂盒，ABI 7900型实时荧光定量PCR仪（美国Applied Biosystems）。

1.3 方法

1.3.1 qRT-PCR检测CTTN mRNA和miR-545-3p的表达水平：将手术中切除的胰腺癌组织及癌旁正常组织（距肿瘤组织≥5 cm）置于液氮中冷冻后保存。行Trizol法获取组织中的总RNA，经分光光度法和凝胶电泳检测RNA的浓度与质量。将适量的RNA样品通过逆转录酶制备cDNA。使用SYBR Green法通过PCR仪进行CTTN mRNA和miR-545-3p的表达水平检测。引物序列：CTTN正向引物 5’-CAGGCCGACCGAGTAGACAAGA-3’和反向引物 5’-CGATACCGTATTTGCCGCCGAA-3’；miR-545-3p 正向引物 5’-TGGCTCAGTTCAGCAGGAAC-3’和反向引物5’-TGGTGTCGTGGAGTCG-3’；GAPDH正向引物：5’-CATCACTGCCACCCAG-3’和反向引物5’-ATGCCAGTGAGCTTCCC-3’；U6正向引物：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’和反向引物 5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。反应体系为 20 µl，其中上下游引物均为 0.4 µl，2×SYBR Green 为 10 µl，DNA 聚合酶为 1 µl，剩下用 ddH2O补齐。CTTN mRNA和miR-545-3p的相对表达水平通过 2-ΔΔCt法计算。

1.3.2 预后随访：通过电话、微信、门诊或住院复查等方式对出院后的患者进行随访。第一年共随访6次（1次/2个月），第2年随访4次（1次/3个月），第三年随访2次（1次/6个月），随访三年或至患者死亡。对随访期间患者的3年生存率进行统计。

1.4 统计学分析 使用SPSS22.0进行统计处理。符合正态分布的计量资料以均值±标准差（±s）表示，通过t检验进行两组之间的差异比较；计数资料以百分比或频数来表示，通过χ2检验进行两组之间的差异比较；Pearson法进行CTTN mRNA和miR-545-3p相关性分析；绘制Kapplan-Meier生存曲线，通过Log-rank检验进行二组间生存率的差异比较；通过COX回归模型对影响胰腺癌患者生存的危险因素进行分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胰腺癌组织和癌旁正常组织中CTTN mRNA和miR-545-3p表达检测 qRT-PCR结果显示，与癌旁正常组织对比，胰腺癌组织中CTTN mRNA表达明显上调（2.11±0.87 vs 1.02±0.46），miR-545-3p表达显著下调（0.45±0.19 vs 0.97±0.42）,差异均有统计学意义（t=12.895，13.251，均P=0.000）。

2.2 胰腺癌组织中CTTN mRNA与miR-545-3p表达相关性分析 见图1。胰腺癌组织中CTTN mRNA与miR-545-3p表达具有显著负相关性（r=-0.410，P＜0.05）。

图1 Pearson法分析胰腺癌组织中CTTN mRNA与miR-545-3p表达相关性

2.3 胰腺癌组织中CTTN mRNA和miR-545-3p表达与患者临床病理特征的关系 见表1。CTTN mRNA在低中分化、TNM分期Ⅲ期以及存在淋巴结转移胰腺癌患者中的表达水平显著高于高分化、TNM分期Ⅰ，Ⅱ期及未存在淋巴结转移的患者（t=2.685，2.473，3.092，均P＜ 0.05）；miR-545-3p在低中分化、TNM分期Ⅲ期以及存在淋巴结转移胰腺癌患者中的表达水平明显低于高分化、TNM分期Ⅰ，Ⅱ期及未存在淋巴结转移的患者（t=5.260，11.418，4.026，均P＜0.05）。而不同性别、年龄等其他临床病理特征胰腺癌患者CTTN mRNA和miR-545-3p表达，差异均无统计学意义（均P＞0.05）。

表1 胰腺癌组织中CTTN mRNA，miR-545-3p表达与患者临床病理特征的关系（±s）

表1 胰腺癌组织中CTTN mRNA，miR-545-3p表达与患者临床病理特征的关系（±s）

类 别 n CTTN mRNA miR-545-3p相对表达水平 t P 相对表达水平 t P性别 男 82 2.12±0.96 0.196 0.845 0.43±0.16 1.028 0.306女56 2.09±0.75 0.46±0.18年龄（岁） ≥60 75 2.15±0.94 0.605 0.546 0.44±0.17 0.979 0.330＜60 63 2.06±0.78 0.47±0.19慢性胰腺炎 有 76 2.17±0.90 0.874 0.384 0.43±0.15 1.342 0.182无62 2.04±0.83 0.47±0.209新发糖尿病 有 74 2.16±0.94 0.716 0.475 0.44±0.16 0.711 0.478无64 2.05±0.85 0.46±0.17肿瘤部位 胰头 93 2.16±0.94 0.664 0.508 0.44±0.17 1.174 0.242胰体尾部 45 2.05±0.85 0.48±0.22病理类型 导管腺癌 123 2.12±0.95 0.351 0.726 0.44±0.16 1.706 0.090其他 15 2.03±0.81 0.52±0.25肿瘤直径（cm） ≥4 80 2.15±0.87 0.692 0.490 0.43±0.19 1.713 0.089＜4 58 2.05±0.79 0.49±0.22分化程度 低中分化 98 2.25±1.04 2.685 0.008 0.40±0.17 5.260 0.000高分化 40 1.76±0.78 0.58±0.21 TNM分期 Ⅰ，Ⅱ期 48 1.82±0.79 2.473 0.015 0.67±0.22 11.418 0.000Ⅲ期 90 2.27±1.12 0.34±0.12淋巴结转移 有 41 2.51±1.28 3.092 0.002 0.35±0.15 4.026 0.000无97 1.95±0.81 0.49±0.02

2.4 胰腺癌组织中CTTN mRNA和miR-545-3p表达与患者生存率的关系 在对138例胰腺癌患者的随访过程中，死亡患者有115例，死亡率为83.33%。根据CTTN mRNA和miR-545-3p表达量的均值将所有患者依次分为CTTN mRNA高表达组（CTTN mRNA相对表达水平≥2.11，73例）和CTTN mRNA低表达组（CTTN mRNA相对表达水平＜2.11，65例），miR-545-3p高表达组（miR-545-3p相对表达水平≥0.45，67例）和miR-545-3p低表达组（miR-545-3p相对表达水平＜0.45，71例），见图2。经Kapplan-Meier生存曲线分析得出，CTTN mRNA高表达组和CTTN mRNA低表达组生存率分别为9.59%（7/73）和24.62%（16/65），miR-545-3p高表达组和miR-545-3p低表达组生存率分别为25.37%（17/67）和8.45%（6/71）。CTTN mRNA低表达组三年生存率高于CTTN mRNA高表达组生存率（χ2=4.560，P=0.033），miR-545-3p高表达组三年生存率高于miR-545-3p低表达组生存率（χ2=5.941，P=0.015），差异均有统计学意义。

图2 Kapplan-Meier生存曲线分析胰腺癌组织中CTTN mRNA和miR-545-3p表达与患者生存率的关系

2.5 影响胰腺癌患者预后的多因素COX回归分析 见表2。根据随访期间胰腺癌患者是否生存（0=是，1=否）作为因变量，将患者的临床病理特征分化程度、TNM分期、淋巴结转移以及CTTN mRNA和miR-545-3p表达作为自变量。经过多因素COX回归分析得出，存在淋巴结转移、高CTTN mRNA表达和低miR-545-3p表达是胰腺癌患者预后三年死亡的危险因素（P＜0.05）。

表2 影响胰腺癌患者预后的多因素COX回归分析

3 讨论

胰腺癌是一种具有致命风险的高侵袭性恶性肿瘤，主要见于男性和老年人（60～85岁），现在越来越多的在年轻患者中观察到胰腺癌。由于该病无早期症状，可迅速侵入周围组织器官，是最致命的癌症之一。以往的研究发现，人体微生物代谢异常、血型、糖脂水平异常等也是胰腺癌发生发展的重要因素[8-9]。确定早期诊断方案是提高胰腺癌检出率和生存率的重要途径。然而，现有的许多与胰腺癌相关的肿瘤标志物都不是高度特异性的。因此，对胰腺癌的分子生物学是当前研究的热点。

皮层肌动蛋白（CTTN）是一种细胞骨架肌动蛋白结合调节蛋白，通过Src介导的酪氨酸磷酸化进行调节。据报道，CTTN可参与各种细胞功能，包括肌动蛋白聚合、细胞运动结构（如足小体和侵袭伪足）的形成以及细胞外基质-蛋白质沉积，CTTN的这些功能可导致失调的细胞迁移、侵袭和转移[10-11]。早期研究显示，CTTN参与调控恶性肿瘤活动，在高侵袭性原发性肝癌中的表达明显上调，并与肝癌的转移能力相关，其高表达可能作为肝癌转移能力增高的原因之一[12]。另外，QI等[13]研究表明，CTTN可作为piR-19166靶标基因参与前列腺癌的迁移和远处转移，可为前列腺癌的早期诊断和治疗提供帮助。在本研究中，CTTN mRNA在胰腺癌中的表达水平显著高于癌旁正常组织，且CTTN mRNA表达与胰腺癌患者分化程度、TNM分期和淋巴结转移相关。表明CTTN在胰腺癌中具有致癌因子的作用，暗示降低CTTN表达可抑制乳腺癌进展。此外，在鼻咽癌细胞中证实，抑制CTTN表达对肿瘤细胞的迁移和侵袭有明显的抑制作用[14]。张九娜等[15]发现，敲低CTTN可明显降低增殖相关蛋白PCNA的表达水平，增高凋亡相关蛋白cleaved-caspase 3的表达水平，同时通过抑制PI3K-AKT通路抑制食管癌细胞的增殖，促进其凋亡。以上证据表明，CTTN可能在胰腺癌的早期治疗和诊断中具有重要意义。

miRNA是一类在翻译后调控mRNA表达的小分子RNA，在肿瘤上皮间质转化、微环境改变等恶性肿瘤的转移过程中具有关键作用，参与调控胰腺癌在内的多种肿瘤细胞的恶性生物学行为[16]。位于染色体Xq13.2的miR-545-3p在多种肿瘤中发挥重要作用。近期研究显示，miR-545-3p在非小细胞肺癌中低表达，与肿瘤细胞的生物学行为有关[7]。在神经母细胞中，miR-545-3p过表达可抑制肿瘤发生并促进肿瘤放射敏感性[17]。本结果表明，胰腺癌组织中miR-545-3p表达降低，且其表达与胰腺癌的分化程度、TNM分期以及淋巴结转移有关。表明miR-545-3p可在胰腺癌中发挥抑癌基因的作用。miR-545-3p表达的降低可能引发胰腺癌细胞的增殖分化、转移机制异常进而促进胰腺癌的发展。另外，已有研究证明，CTTN还可作为miRNA的靶基因参与肿瘤细胞的发生和发展[18]。此外，经Starbase数据库预测，miR-545-3p与CTTN存在靶向调控关系。另外，本研究胰腺癌组织中CTTN的mRNA表达与miR-545-3p表达呈现明显负相关，提示CTTN可能作为miR-545-3p的靶基因在胰腺癌中发挥作用；低表达的miR-545-3p可能促进CTTN mRNA表达，进而发挥致癌作用，然而二者之间的具体作用机制仍需继续探究。进一步随访结果表明，CTTN mRNA，miR-545-3p表达与胰腺癌患者的预后有关，且CTTN mRNA高表达和miR-545-3p低表达是患者术后三年死亡的危险因素，为评估胰腺癌患者的预后提供依据。

综上，胰腺癌组织中CTTN mRNA呈高表达，miR-545-3p呈低表达，二者呈明显负相关，且与患者的分化程度、TNM分期、淋巴结转移以及预后不良有关。推测CTTN可能作为miR-545-3p的靶基因参与胰腺癌的发生发展过程，二者有望作为胰腺癌的潜在治疗靶点。然而，本研究并未对CTTN与miR-545-3p之间的作用机制进行探索，后续将重点对二者之间的可能机制进行深入研究。本研究为了解胰腺癌组织中CTTN和miR-545-3p表达的变化及相关的分子机制提供新的思路和理论依据。