下呼吸道分离高毒力肺炎克雷伯菌和经典肺炎克雷伯菌常见耐药基因检测以及耐药性比较分析

吕承秀,王君君,李 庆（淄博市第一医院检验科,山东淄博 255200）

肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)分为高毒力肺炎克雷伯菌(hypervirulentKlebsiella pneumoniae，hvKP)和经典肺炎克雷菌(classical Klebsiella pneumoniae，cKP)。hvKP含有毒力质粒，毒力质粒含有铁载体合成基因(如气杆菌素合成基因iucA)以及黏液表型调节因子A（regulator of mucoid phenotype A，rmpA）等，毒力质粒的存在增强了细菌的毒力，hvKP引起感染经常出现在多个部位或随后转移扩散[1]。cKP是一种机会致病菌，毒力弱但菌株易通过水平基因转移方式获得耐药基因，主要引起免疫功能低下患者的院内感染。

传统观点认为，hvKP具有毒力强但对抗生素耐药率低的特点，cKP具有毒力弱但对抗生素耐药率高的特点，近年来研究发现毒力质粒和耐药质粒可在hvKP和cKP菌体内通过水平基因转移方式（如质粒的接合作用）进化而成多重耐药的hvKP，菌株同时具有毒力高和抗生素耐药率高的特点，给临床治疗带来了极大的挑战[2-3]，中国细菌耐药监测数据显示，自2017年起肺炎克雷伯菌在呼吸道标本的分离率居第一位，因此，本研究对下呼吸道分离hvKP和cKP常见耐药基因及耐药性进行比较分析，为临床抗感染治疗提供流行病学依据。

1 材料与方法

1.1 菌株来源 收集淄博市第一医院2019年8月～2021年12月下呼吸道标本分离的200株非重复肺炎克雷伯菌（所有菌株均经微生物质谱仪鉴定为肺炎克雷伯菌，菌株种水平鉴定结果可信），其中分离自痰标本175株，分离自支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid, BALF）标本 25 株。菌株保存于-80℃超低温冰箱。

1.2 仪器与试剂 全自动医用PCR分析系统（上海宏石医疗科技有限公司），电泳仪（美国Bio-Rad公司），全自动凝胶成像仪（美国Protein Simple公司）。PCR引物及琼脂粉（上海生工有限公司），2×Taq Master Mix PCR扩增反应液及Ultra GelRed核酸染液（南京诺唯赞有限公司），药敏纸片（温州康泰有限公司、美国Oxoid公司）。

1.3 方法

1.3.1 毒力基因及耐药基因检测：煮沸法提取菌株DNA。参照文献[4]报道，PCR检测毒力基因(iucA，rmpA，peg-344)。参照文献[5-8]报道，PCR扩增检测11种耐药基因，包括6种ESBLs耐药基因(blaTEM，blaSHV，blaCTX-1group，blaCTX-2group，blaCTX-3group，blaCTX-4group)和5种喹诺酮耐药基因(qnrA，qnrB，qnrS，acc(6’)-Ⅰ b，qepA)。每种基因各选取一株阳性扩增产物送生工生物工程（上海）有限公司进行一代测序，将测序结果提交NCBI网站进行基因比对，确认所扩增的基因片段。

1.3.2 药敏试验：参照 2021年美国临床实验室标准化协会（CLSI）推荐的药敏试验要求，按全国细菌耐药监测网（CARSS）技术方案，采用纸片扩散法进行，药敏试验质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922和大肠埃希菌产酶株ATCC35218。

1.4 统计学分析 抗生素药敏结果采用WHONET 5.6软件对数据进行统计学分析；计数资料采用频数和百分数表示，应用SPSS 20.0对数据进行统计学分析，组间比较采用卡方（χ2）检验或Fisher确切概率法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 毒力基因检测结果 200株肺炎克雷伯菌中，iucA阳性107株，占比53.50%；prmpA阳性107株，占比53.50%；peg-344阳性108株，占比54.00%。根据文献报道[9-10]，将毒力基因iucA，rmpA和peg-344基因均阳性的肺炎克雷伯菌定义为hvKP，其余菌株定义为cKP。200株肺炎克雷伯菌中hvKP 91株，占比45.50%，cKP 109株，占比54.50%。

2.2 耐药基因检测结果 药敏结果显示，10株hvKP产 ESBLs，33株 cKP产 ESBLs；43株 产 ESBLs的肺炎克雷伯菌进行ESBLs耐药基因检测；19株hvKP对喹诺酮类药物环丙沙星或左氧氟沙星耐药，56株cKP对喹诺酮类药物环丙沙星或左氧氟沙星耐药，75株喹诺酮类药物的肺炎克雷伯菌进行喹诺酮类耐药基因检测。

2.2.1 ESBLs耐药基因检测结果：10株hvKP中，blaTEM阳性菌株为7株，占比70.00%；blaSHV阳性菌株10株，占比100.00%；blaCTX-1group阳性菌株7株，占比70.00%；blaCTX-4group阳性菌株为2株，占比20.00%；未发现blaCTX-2group阳性菌株及blaCTX-3group阳性菌株；携带有三种及以上ESBLs耐药基因的菌株为6株，占比60.00%。33株cKP中，blaTEM阳性菌株为24株，占比72.73%；blaSHV阳性菌株33株，占比100.00%；blaCTX-1group阳性菌株22株，占比66.67%；blaCTX-3group阳性菌株为8株，占比24.24%；blaCTX-4group阳性菌株为5株，占比15.15%；未发现blaCTX-2group阳性菌株；携带有三种及以上ESBLs耐药基因的菌株为25株，占比75.76%。

2.2.2 喹诺酮类耐药基因检测结果：19株hvKP中，qnrB基因阳性菌株6株，占比31.58%；qnrS基因阳性菌株7株，占比36.84%；acc（6’）-Ⅰb基因阳性菌株6株，占比31.58%；未发现qnrA基因、qepA基因阳性菌株。携带三种及以上喹诺酮类耐药基因菌株为4株，占比21.05%。56株cKP中，qnrB基因阳性菌株17株，占比30.36%；qnrS基因阳性菌株45株，占比80.36%；acc（6’）-Ⅰb基因阳性菌株22株，占比39.29%；未发现qnrA基因、qepA基因阳性菌株。携带三种及以上喹诺酮类耐药基因菌株为9株，占比16.07%。

2.3 hvKP与cKP的耐药性比较

2.3.1 hvKP与cKP的抗生素耐药率比较：见表1。91株hvKP与109株cKP药敏结果显示，hvKP对临床常用抗生素耐药率均低于15%，而cKP对头孢唑林、头孢呋辛、头孢噻肟、环丙沙星和复方新诺明的耐药率均大于30%。hvKP与cKP对临床常用抗生素的耐药率进行比较分析，hvKP对头孢唑林、头孢呋辛、头孢噻肟、阿莫西林/克拉维酸、左氧氟沙星、环丙沙星和复方新诺明的耐药率低于cKP，差异均有统计学意义（均P<0.05）。hvKP中产超广谱β-内酰胺酶菌株数低于cKP中产超广谱β-内酰胺酶菌株数，差异有统计学意义（P<0.05）。

表1 hvKP与cKP的抗生素耐药率比较（%）

2.3.2 hvKP与cKP的耐药基因阳性率比较：见表2。10株产超广谱β-内酰胺酶的hvKP与33株产超广谱β-内酰胺酶的cKP进行ESBLs耐药基 因（blaTEM，blaSHV，blaCTX-1group，blaCTX-2group，blaCTX-3 group，blaCTX-4group）阳性率比较分析，ESBLs耐药基因在hvKP与cKP的阳性率差异无统计学意义（均P>0.05）。

表2 hvKP与cKP的ESBLs耐药基因阳性率比较（%）

hvKP与cKP的喹诺酮耐药基因阳性率比较见表3。19株对喹诺酮类药物耐药的hvKP与56株对喹诺酮类药物耐药的cKP进行喹诺酮耐药基因(qnrA，qnrB，qnrS，acc(6’)-Ⅰ b，qepA) 阳性率比较分析，qnrS在hvKP的阳性率低于cKP，差异有统计学意义，其他喹诺酮耐药基因在hvKP与cKP中的阳性率差异无统计学意义（均P>0.05）。

表3 hvKP与cKP的喹诺酮耐药基因阳性率比较（%）

3 讨论

国内研究发现临床分离的肺炎克雷伯菌以下呼吸道标本为主[11]，因此本研究以下呼吸道分离的200株非重复肺炎克雷伯菌作为研究对象。肺炎克雷伯菌分为hvKP和cKP，随着多重耐药hvKP报道的不断增多，hvKP已成为一种令人担忧的全球性病原体[12-14]。关于hvKP的定义目前尚无统一标准，小鼠动物模型是鉴定hvKP的方法之一，但由于实验周期较长，实验条件要求高，操作复杂，不适合应用于临床。目前临床多用菌株拉丝实验鉴别hvKP，拉丝实验操作虽然简单，但是并非所有hvKP拉丝实验阳性，因此该实验会造成hvKP的漏检。黏液表型调节因子A（rmpA）通过调控荚膜多糖的合成，对hvKP抵抗宿主的免疫应答并在宿主体内繁殖起着重要作用；气杆菌素合成基因iucA编码合成铁载体气杆菌素，气杆菌素增强hvKP在宿主体内获得铁的能力，有力于细菌在宿主体内的生长繁殖；内膜转运蛋白合成基因peg-344位于hvKP毒力质粒上，hvKP在人腹腔积液中生长时，peg-344的RNA丰度增加，但其具体功能还不清楚；RUSSO等[4]研究发现毒力基因peg-344与iucA基因联合检测可提高hvKP鉴定准确度达到0.98，优于传统的菌株拉丝实验，考虑到cKP中同样可能存在毒力基因，为进一步提高hvKP鉴定的准确度，根据PARROTT等[9-10]的研究，本研究将毒力基因iucA，rmpA和peg-344均阳性的菌株定义为hvKP，其余菌株定义为cKP，研究发现下呼吸道分离肺炎克雷伯菌中hvKP占比45.50%，与JUAN等[15]研究的hvKP感染在肺炎克雷伯菌感染引起肺炎中占比一致。

本研究对hvKP和cKP中产ESBLs及喹诺酮耐药的菌株进行ESBLs耐药基因、喹诺酮耐药基因检测，研究发现hvKP和cKP的ESBLs耐药基因均以blaSHV，blaTEM，blaCTX-1group(1，3，15)为主要基因型，喹诺酮类耐药基因均以qnrS，acc（6’）-Ⅰb和qnrB为主要基因型，且发现耐药菌株中通常含有多种耐药基因，与CARVALHO等[16]的研究结果一致；细菌在多种耐药基因的协同作用易增强对抗生素的耐药性以及对多种抗生素耐药。

耐碳青霉烯类抗生素的hvKP（carbpenemresistant hypervirulentKlebsiella pneumoniae，CR-hvKP）同时具有毒力强和临床常用抗生素耐药率高的特点，感染CR-hvKP患者临床治愈率低，临床治疗面临着极大的挑战[17]。本研究对下呼吸道分离的hvKP药敏结果进行分析发现，hvKP对临床常用抗生素仍保持较低的耐药率，未发现CR-hvKP；本研究hvKP药敏结果低于LIU等[18]的研究结果，分析原因可能与同期抗生素暴露以及地区间差异相关[19]。hvKP与cKP抗生素结果进行比较分析发现，hvKP对临床常用抗生素如头孢菌素类、喹诺酮类等药物耐药率低于cKP，说明本院下呼吸道分离hvKP对临床常用抗生素仍保持较低的耐药率，临床医生应根据药敏结果合理应用抗生素。hvKP与cKP耐药基因阳性率比较发现，qnrS在hvKP的阳性率低于cKP，分析原因为qnrS是cKP中阳性率最高的喹诺酮类耐药基因[20]，而且携带qnrS基因的质粒与携带其它喹诺酮类耐药基因及（或）ESBLs耐药基因的质粒不同，具体的机制还需进一步研究。本研究检测的耐药基因多位于质粒上，研究发现除qnrS在hvKP和cKP中阳性率存在差异外，其他ESBLs耐药基因及喹诺酮类耐药基因在hvKP和cKP中的种类及阳性率未见差异。因此临床应加强多重耐药菌的院感防控，阻断携带耐药基因的质粒通过接合作用等水平基因转移方式进入hvKP菌株体内从而进化为多重耐药的hvKP。因为本院下呼吸道分离的肺炎克雷伯菌的耐药率较低，产ESBLs的菌株数少，所以ESBLs耐药基因的研究结果可能存在偏移，后续需加大菌株数进行验证。

综上所述，下呼吸道分离hvKP与cKP耐药菌株中耐药基因主要基因型一致，但是hvKP对临床常用抗生素耐药率低于cKP，临床治疗应根据药敏结果合理应用抗生素。