骨髓增生异常综合征患者外周血单个核细胞中OTC4，Gli1基因的表达及与预后的COX回归分析

张冬梅，万顺伦，于丽华

（1.中国人民解放军海军青岛特勤疗养中心五区检验科，山东青岛 266000；2.中国人民解放军海军第971医院神经内科，山东青岛 266000）

骨髓增生异常综合征（myelodysplastic syndrome,MDS）系一组造血干细胞异常所致肿瘤性疾病，主要表现为难治性血细胞减少、造血功能衰竭[1]。近年研究发现，多种基因异常表达可能参与了MDS发生发展过程。八聚体结合转录因子4（octamer binding transcription factor 4, OTC4）为一种重要的维持胚胎干细胞功能的转录因子，可通过调控磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B, PI3K-AKt）及丝裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase,MAPK）信号通路，参与细胞分化进程[2]。Shh信号通路过度激活被认为与人类多种疾病发生密切相关[3]。Gli1为调控Shh信号通路的关键基因[4]。目前，关于OTC4，Gli1基因与MDS相关研究较缺乏，为此本研究回顾性分析OTC4，Gli1基因在MDS患者外周血单个核细胞中的表达及与患者临床病理特征、预后的关系，以期为MDS发病机制及临床资料提供理论参考，报道如下。

1 材料与方法

1.1 研究对象 回顾性分析2017年3月～2018年3月间收治的54例MDS患者临床资料，其中男性31例、女性23例，年龄为36～79（57.09±11.08）岁。另选取40例同期体检健康者为对照组，其中男性23例、女性17例，年龄为38～78（57.25±11.14）岁。两组受检者性别、年龄比较，差异无统计学意义（P>0.05）。本研究符合《世界赫尔辛基宣言》相关要求。纳入标准：①符合《骨髓增生异常综合征中国诊断与治疗指南(2019年版)》[5]（下文简称指南）中关于MDS诊断标准，且经骨髓流式细胞术检查、染色体核型分析等检查确诊；②入组前未接受放、化疗；③临床资料完整。排除标准：①再生障碍性贫血、先天性血液系统疾病（如先天性红细胞生成异常性贫血）者；②并发严重心、肝、肾功能障碍者；③并发其他恶性肿瘤者；④并发自身免疫病、甲状腺疾病者；⑤并发严重感染性、炎症性疾病者；⑥并发精神疾病，无法配合随访者；⑦临床资料不全者。

1.2 仪器与试剂 淋巴细胞分离液（上海研谨生物科技有限公司），TRIzol试剂（美国Invitrogen），PrimeScript RT Reagent Kit反转录试剂盒 （日本TaKaRa），Alpha 1506型紫外分光光度计（上海谱元仪器有限公司），RT-PCR定量试剂盒（深圳晶美生物工程有限公司），7900型实时荧光定量PCR仪（美国ABI），本研究引物均由英潍捷基（上海）贸易有限公司设计合成。

1.3 方法

1.3.1 标本制备：以无菌穿刺法采集所有受检者3 ml骨髓血，EDTA抗凝，离心处理（400×g，20 min），滴加骨髓标本体积一半的淋巴细胞分离液，缓慢将骨髓稀释液滴入淋巴细胞分离液上层，离心处理（4℃，350×g，8 min），可见中上层白雾状的单个核细胞层，以玻璃吸管将该层细胞移至预先标记离心管内，并用磷酸缓冲盐溶液（PBS）清洗后滴加RPMI 1640培养液及二甲基亚砜（Dimethyl sulfoxide,DMSO）配置成细胞悬液，-80℃冷存待检。

1.3.2 RT-PCR检测：以TRIzol试剂提取总RNA，以紫外分光光度计测定其纯度、浓度，再以Prime-Script RT Reagent Kit反转录试剂盒合成cDNA，OCT4以GAPDH内参基因，Glil以β-actin为内参基因，分别进行RT-PCR扩增，引物序列见表1。OCT4扩增体系（共20 μl）：1 μl cDNA+上、下游引物各 1 μl+10 μl 1×SYBR Green Mastermix-+ddH2O（加至20μl）；反应条件：预变性（95℃，30s）、变性（95℃5s）、退火（60℃30s）、延伸（60℃30s，共40～45个循环）。Glil扩增体系（共25 μl）：上、下游引物各0.1 μl+2 μl cDNA+2.5 μl 10×PCR反应缓冲液+0.5 μl dNTP混合液+0.5 μlDNA聚合酶+ddH2O（加至25μl）；反应条件：预变性（95℃1min）、变性（95℃15s）、退火（60℃15s）、延伸（72℃30s），共40个循环。OTC4，Gli1基因相对表达水平以2-ΔΔCt法计算，其中ΔCt=AVG目的基因－AVG内参基因，以副孔检测，AVG 表示目的基因Ct检测值。

表1 PCR扩增引物序列

1.3.3 随访：所有患者均接受电话随访或门诊复查，随访截止至2021年3月，记录所有患者预后情况，将存活患者纳入生存组（n=31），死亡患者纳入死亡组（n=23）。总生存时间（overall survival,OS）定义为从治疗开始至因MDS死亡的时间或至随访截止日，无进展生存期（progress-free survival,PFS）定义为治疗开始至第一次发生疾病进展或因MDS死亡的时间。

1.4 统计学分析 数据采用SPSS 22.0软件处理。计数资料以n(%)表示，组间比较采用χ2检验；正态分布计量资料以（±s）表示，组间比较采用独立样本t检验；采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，Log-rank法检验OS，PFS；采用COX多因素回归分析MDS患者预后影响因素。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 OTC4，Gli1基因在MDS患者及对照组中的表达比较 OTC4（2.78±0.31），Gli1（1.35±0.33）基因在MDS患者中的相对表达水平明显高于健康对照组（1.07±0.17, 0.53±0.13），差异有统计学意义（t=31.524, 14.868,P<0.05）。

2.2 OTC4，Gli1基因表达与MDS患者临床病理特征关系 见表2。OTC4，Gli1基因表达与MDS患者年龄、性别、BMI，WBC，WHO（2008）分型无关（均P>0.05）。OTC4基因表达与MDS患者Hb，PLT，IPSS-R危险分层有关；Gli1基因表达与MDS患者PLT，IPSS-R危险分层有关（P<0.05），而与Hb无关（P>0.05）。

表2 OTC4，Gli1基因表达与MDS患者临床病理特征关系（±s）

表2 OTC4，Gli1基因表达与MDS患者临床病理特征关系（±s）

注：BMI：体质量指数；Hb：血红蛋白；PLT：血小板计数；WBC：白细胞计数；RCUD：难治性血细胞减少伴单系病态造血；RARS：难治性贫血伴环状铁粒幼细胞；RCMD：难治性血细胞减少伴多系病态造血；RAEB-1：难治性贫血伴原始细胞增多-1；RAEB-2：难治性贫血伴原始细胞增多-2。

类 别 n OTC4 t P Gli1 t P性别 男 31 2.83±0.33 1.306 0.197 1.40±0.32 1.345 0.185女23 2.72±0.27 1.28±0.33年龄（岁） <60 32 2.74±0.27 1.050 0.299 1.30±0.31 1.326 0.191≥60 22 2.83±0.36 1.42±0.35 BMI（kg/m2） <24 39 2.79±0.30 0.209 0.835 1.34±0.33 0.099 0.922≥24 15 2.77±0.35 1.35±0.34 Hb（g/L） <80 33 2.84±0.31 4.145 <0.001 1.45±0.31 0.711 0.480≥80 21 2.49±0.29 1.39±0.29 PLT（×109/L） <50 20 2.84±0.32 2.085 0.042 1.46±0.30 2.722 0.009≥50 34 2.67±0.27 1.21±0.34 WBC（×109/L） <4 24 2.73±0.28 1.064 0.292 1.34±0.34 0.218 0.828≥4 30 2.82±0.33 1.36±0.33 WHO（2008）分型 RCUD/RARS/RCMD 17 2.79±0.33 0.108 0.914 1.37±0.36 0.205 0.838 RAEB-1/RAEB-2 37 2.78±0.31 1.35±0.32 IPSS-R危险分层 极低危/低危/中危 22 2.60±0.30 2.430 0.019 1.35±0.33 2.282 0.027高危/极高危 32 2.81±0.32 1.59±0.41

2.3 MDS患者生存分析见表3，图1～4。生存组患者OS，PFS分别为31.08±5.07个月和26.06±3.07个月，均明显长于死亡组患者（25.05±4.06个月,19.03±2.83个月），差异有统计学意义（t=4.692, 8.599，均P<0.05）。生存组患者OTC4，Gli1基因相对表达水平分别为2.51±0.32，1.24±0.37，均明显低于死亡组患者（2.90±0.43,1.55±0.44），差异有统计学意义（t=3.824，2.808，均P<0.05）。通过ROC曲线求得OTC4，Gli1基因Cut-off值分别为2.77，1.77，按OTC4基因表达将MDS患者分为低表达组（<2.77，34例）和高表达组（>2.77，20例），同理可得，Gli1基因低表达组（<1.77，43例）和高表达组（>1.77，11例）。生存曲线分析显示，OTC4，Gli1基因低表达MDS患者OS，PFS均明显长于OTC4，Gli1基因高表达MDS患者水平，差异均有统计学意义（P<0.05）。

表3 不同OTC4，Gli1基因表达水平的MDS患者Kaplan-Meier生存曲线分析结果

图1 不同OTC4基因表达水平的OS曲线

图2 不同OTC4基因表达水平的PFS曲线

图3 不同Gli1基因表达水平的OS曲线

图4 不同Gli1基因表达水平的PFS曲线

2.4 MDS患者预后的影响因素分析 单因素分析显示，年龄、PLT，WBC，WHO（2008）分型、IPSS-R危险分层、OTC4基因相对表达水平、Gli1基因相对表达水平与MDS患者预后有关（P<0.05）；而性别、BMI，Hb与MDS患者预后无关（P>0.05）。见表4。以预后为因变量（0=生存，1=死亡），以年龄、PLT，WBC，WHO（2008）分型、IPSS-R危险分层、OTC4基因相对表达水平、Gli1基因相对表达水平为自变量纳入COX多因素回归分析模型。见表5、表6。结果显示，WBC，WHO（2008）分型、IPSS-R危险分层、OTC4基因相对表达水平、Gli1基因相对表达水平均为阳性MDS患者预后的独立影响因素（P<0.05）。

表4 MDS患者预后的单因素分析[n(%)]

表5 赋值表

表6 MDS患者预后的COX多因素回归分析

3 讨论

MDS系一类具有明显异质性疾病，其发病机制复杂，可能涉及表观遗传学、免疫系统改变、造血干细胞基因突变、染色体失稳定性等多种因素[6]。目前，MDS治疗方式众多，其中异基因造血干细胞移植最为常见，但部分患者因免疫功能低下及并发基础疾病，导致治疗效果不佳，病情进展为急性白血病而死亡。近年来研究发现，MDS患者中存在某些基因表达异常，且其表达水平与患者预后密切相关[7]。因此，探讨相关基因在MDS患者外周血单个核细胞中的表达并分析其与预后的关系具有重要意义。

OTC4基因定位于人6号染色体，长约16.5 kb，转录位点众多，主要参与人体细胞增殖、发育、分化、凋亡等过程[8]。GUINDY等[9]发现，OTC4基因在肝癌、肾癌、白血病等多种恶性肿瘤中表达上调，其异常表达可能与恶性肿瘤发生、发展有关。而YOU等[10]研究指出，OTC4基因高表达患者预后较OTC4基因低表达患者明显更差。本研究结果显示，MDS患者外周血单个核细胞中OTC4基因表达水平明显高于健康对照组，和张永晓等[11]报道结果相同，提示OTC4基因异常上调可能促进MDS发生。进一步分析显示，Hb水平低、PLT水平低、IPSS-R危险分层为高危/极高危患者OTC4基因表达明显升高，说明OTC4基因参与了MDS发展过程，分析原因可能与OTC4基因表达上调致使骨髓造血干细胞中的细胞分化相关基因表达异常有关。而在OTC4基因表达与MDS患者预后分析中发现，OTC4基因低表达患者OS，PFS均明显长于OTC4基因高表达患者，OTC4基因表达水平为影响MDS患者预后的独立因素之一，提示OTC4基因高表达可能为MDS患者预后不良的影响因素。

目前，关于Shh通路与MDS关系的报道较少，而Shh通路被证实参与人体多种疾病发病过程[12]。Shh通路由Shh配体、G蛋白偶联磷酸化受体Smo，跨膜蛋白受体PTCH及下游转录因子Gli蛋白组成，当Shh通路被激活时，Hh配体和靶细胞中的PTCH结合，解除对Smo抑制，活化Gli蛋白，使其进入细胞核中和启动子结合，最终实现对多种靶基因调控。Gli1基因为Shh通路中的强激活子，其表达水平可反映Shh通路激活程度[13]。LAU BW等[14]研究表明，Gli1基因在胰腺癌、结肠癌、前列腺癌、肺癌、白血病等发生、发展中具有重要作用。本研究结果显示，MDS患者外周血单个核细胞中Gli1基因表达水平明显高于健康对照组，与银臻等[15]的研究结果一致，提示Gli1异常激活可能促进了MDS发生。进一步分析显示，PLT水平低、IPSS-R危险分层为高危/极高危患者Gli1基因表达明显升高，说明Gli1基因参与了MDS发展过程，推测可能与Gli1基因表达上调诱导正常造血干细胞转化成肿瘤干细胞，并调控肿瘤干细胞分化、抗凋亡等过程有关。而在Gli1基因表达与MDS患者预后分析中发现，Gli1基因低表达患者OS，PFS均明显长于Gli1基因高表达患者，Gli1基因表达水平为影响MDS患者预后的独立因素之一，提示Gli1基因高表达可能为MDS患者预后不良的影响因素。

由上述结果可知，OTC4，Gli1基因异常上调和MDS发生、发展及不良预后相关，抑制OTC4基因表达及阻断Shh信号通路可能为MDS潜在治疗靶点。此外，本研究还发现除OTC4，Gli1基因外，WBC，WHO（2008）分型、IPSS-R危险分层均为影响MDS患者预后的独立因素，与王颖等[16]研究结果相符。分析原因可能为：①WBC水平：MDS主要特征表现为外周血细胞水平降低，而WBC为反映外周血水平常用指标，其水平越低代表患者造血功能异常越严重，使得机体血液供应障碍，降低机体免疫力，从而增大感染，进展为急性白血病风险，进而影响患者预后[17]。②WHO（2008）分型及IPSS-R危险分层：临床中多将两者联合应用评估MDS患者预后。相对高危患者病情程度较重，骨髓造血细胞多不可逆性凋亡，使得患者因造血衰竭而出现呼吸衰竭、心力衰竭等严重并发症，从而影响患者预后[18]。

综上所述，OTC4，Gli1基因在MDS患者外周血单个核细胞中呈高表达，且与WBC，WHO（2008）分型、IPSS-R危险分层为影响MDS患者预后的独立因素。抑制OTC4，Gli1基因表达有望成为MDS潜在治疗靶点。本研究存在以下不足，首先，样本量较少可能会对结果产生偏倚；其次，本研究为横断面回顾性研究；最后，未分析OTC4，Gli1基因对MDS患者预后的预测价值。以上不足有待进一步行大样本、前瞻性、随机对照实验予以完善。