散装即食食品中金黄色葡萄球菌检测方法研究进展

◎ 陈志敏

（石家庄市食品药品检验中心，河北 石家庄 050011）

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是一种严重危害人类健康的食源性致病菌，是革兰氏阳性菌的典型代表菌，无芽胞和鞭毛，大多数无荚膜，革兰氏染色呈阳性[1]。在一定的生长条件下，金黄色葡萄球菌会合成肠毒素且该菌具有较强的菌膜形成能力，广泛地存在于自然界的空气、污水等环境中。菌膜是耐药性传播的一种潜在载体，研究发现金黄色葡萄球菌存在多重耐药现象。目前世界各国均把金黄色葡萄球菌列为食品卫生的法定检测项目。

散装即食食品是提供给消费者可直接食用的非预包装食品（含预先包装但需要计量称重的散装即食食品）。相对于预包装食品而言，散装食品在制作、销售过程中，容易受器具、工作人员等环节的污染，更具引发食源性疾病的潜在风险。近年国内外散装即食食品微生物监测数据显示，食源性致病菌的检出比例较高，由金黄色葡萄球菌等食源性致病菌引发的食源性疾病屡见不鲜[2]。正因如此，食品安全国家标准《食品安全国家标准 散装即食食品中致病菌限量》（GB 31607—2021）[3]应运而生，其中明确规定了金黄色葡萄球菌在各类散装即食食品中的检测标准及限量要求。

本文拟对食品中金黄色葡萄球菌目前存在的较常见的检测方法作系统介绍，以期在散装即食食品中金黄色葡萄球菌检测的进一步深入研究以及国家卫生标准的制定提供参考。

1 以传统微生物分离培养为基础的检测方法

《食品安全国家标准 食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验》（GB 4789.10—2016）[4]中要求将传统培养法作为金黄色葡萄球菌的检测方法，该标准是检测金黄色葡萄球菌的国家强制标准。区楚君等[5]通过改进国家标准方法，挑取疑似菌落在含有质量分数4%琼脂和体积分数2%乙醇的胰蛋白酶大豆琼脂上进行分离，分离率由2.61%提至19.98%，可有效避免假阴性结果，提高准确度。测试片法是以传统培养法为基础进行商品化后的产物，主要以3M公司的Petrifilm Staph Express Count Plate为代表。董娜等[6]通过优化已有复配比例，并与国家标准方法比对发现，优化已有复配比例得出的结果线性相关性良好，检出限可达到2 CFU·mL-1，可应用于金黄色葡萄球菌的检测。此外，研究发现将传统分离培养法得到的可疑菌株与全自动微生物分析仪或基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱仪联用以增强检测结果的时效性、准确性[7-8]。因此，可通过此方法在食品抽检机构中尤其是散装即食食品这种流通快、检测时效要求高的样品中实现快速、准确检测。

2 以分子生物学为基础的检测方法

2.1 PCR技术

PCR是聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）的简称，是目前检测金黄色葡萄球菌的最常用方法之一，具有快速、灵敏、特异性好等优点。但由于食品成分的复杂性及食品加工时可能破坏了DNA且可扩增已死亡的金黄色葡萄球菌DNA造成假阳性结果，限制了PCR技术在检测食品病原菌上的应用。近年来，以常规PCR为基础技术的各种新型PCR技术不断出现，使食品中微生物的检测愈来愈快捷、简便，同时弥补了常规PCR技术灵敏度低的缺陷。

2.1.1 实时荧光定量PCR方法

实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time，PCR）技术是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次PCR循环后产物总量的方法。因其在检测通量高、时效性好、灵敏度高等方面的优势得以迅速发展。范维等[9]建立了同时检测沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌的多重实时聚合酶链式反应方法，并对散装即食肉制品进行检测，均与国家标准方法检测结果一致，证明该方法可用于散装食品中3种致病菌的检测。

2.1.2 PCR与膜芯片杂交技术

PCR与膜芯片杂交技术是指将采集的样品通过混合培养基得到浓缩溶液，进而提取并纯化DNA后，采用PCR与膜芯片技术联用检测样品中的致病菌。杨丹妮等[10]利用膜芯片的特异与多重PCR结合，检测9种食源性致病菌，实现了同一平台同时检测多种食源性致病菌，在提高检测通量的同时提高了检测效率，为食品安全风险监控提供了有效手段。

2.1.3 微滴式数字PCR

微滴式数字PCR（droplet digital Polymerase Chain Reaction，ddPCR）是基于传统的PCR扩增前对样品进行微滴化处理的一种新型PCR。赵丽青等[11]将叠氮溴化丙锭与微滴式数字PCR技术结合进行定量检测金黄色葡萄球菌活菌，检出限可达到1×102CFU·mL-1，在实际应用中具有极高的应用价值。

2.2 环介导等温扩增技术

DNA环介导恒温扩增技术（Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP），是一种适用于基因诊断的恒温核酸扩增技术，其特点是灵敏度高，反应时间短。郭建平等[12]利用金黄色葡萄球菌特异性靶点基因SAR0395建立一种可视化LAMP检测方法，该方法不需要昂贵的设备且操作简单，可实现在设备较落后的地区进行金黄色葡萄球菌的快速检测。

2.3 重组酶聚合酶扩增技术

重组酶聚合酶恒温扩增技术（Recombinase Polymerase Amplication，RPA）是一种新的核酸等温扩增技术，依赖于能结合单链核酸的重组酶、单链DNA结合蛋白和具有链置换活性的DNA聚合酶，其反应灵敏性高，特异性强，可以真正实现便携式的现场、快速核酸检测。后来旺等[13]建立RPA结合侧流层析试纸条的快速检测方法，其与微生物生化鉴定法总符合率为95.3%。

2.4 实时荧光核酸恒温扩增检测技术

实时荧光核酸恒温扩增检测（Real-Time Simultaneous Amplification and Testing，SAT） 方 法 的 靶 标 是RNA，扩增产物也是RNA，且反应全程仅需40 min。李桂金等[14]建立的金黄色葡萄球菌SAT方法，纯培养物检测下限达到1×103CFU·mL-1，其灵敏度高、特异性好、假阳性率低至2.9%，为散装、预包装食品中金黄色葡萄球菌的快速检测提供参考。

3 结语

以往实验室日常检测实际样品中，预包装食品中春卷、速冻面筋、速冻饺子等市售速冻米面制品中金黄色葡萄球菌的阳性率较高，目前国家出台了散装即食食品的卫生标准，散装即食食品中以米面为原料的制品、肉制品成为了食品抽查的重点，因此必须加强散装即食食品食品金黄色葡萄球菌的检验能力。传统国家标准检测方法仍停留在分离培养、形态观察、生化鉴定和血清型分型水平，检测周期较长，且无法对培养难度较大的病原菌进行检测。虽然以分子生物学为基础检测方法检测时间短、特异性强，但是检测成本较高、灵敏性相对较低且因不能区分死菌以及活菌导致假阳性率高，某些新型多技术连用检测方法对实验条件及工作人员的专业能力要求较高，不能得到普及。因此建立快速、操作简便、准确度高且经济的金黄色葡萄球菌检测方法才能应对散装即食食品的检测，从而确保食品安全。