重力场下生物膜表面的金纳米棒吸附

杨 倩, 雷一腾, 马贝贝, 朱 涛, 蒋中英, , 3

(1. 伊犁师范大学 电子与信息工程学院 微纳电传感技术与仿生器械重点实验室, 伊宁 835000；2. 南京大学物理学院 固体微结构物理国家重点实验室, 南京 210093；3.伊犁师范大学 物理科学与技术学院 新疆凝聚态相变与微结构实验室, 伊宁 835000)

1 引 言

纳米颗粒因肿瘤靶向性、多样的物化性质, 具有广阔的生物医学应用前景. 其医学功能性质与颗粒在生物膜表面的吸附行为紧密相关[1]. 吸附动力学与平衡态决定着颗粒的生物相容性、内吞途径及代谢方式[2].

许多国内外课题组开展了纳米颗粒在生物膜表面吸附的研究. 如中科院姜秀娥、南京大学马余强等报道了双亲性化学修饰、蛋白冠等对颗粒吸附及内吞的影响[2-4]. 为了获得高敏感的实时表征, 研究者往往采用界面表征手段, 以处于溶液底层的支撑膜、囊泡来探索颗粒吸附的可控性. 但是, 该模型假设颗粒在溶液中是均匀分布的, 这可能存在缺陷. 夏幼南等发现底层的颗粒浓度显著高于顶层, 差异值与颗粒尺寸、空心实心相关, 重力在浓度不均性中发挥了支配作用[5]. 我们早前的研究也发现了团聚及沉淀对底层颗粒富集的影响[6]. 浓度的改变可造成颗粒在生物膜表面吸附动力学与平衡态的变化[7]. 但是, 作为常见纳米颗粒的调节参量, 颗粒形状是否会影响重力产生的浓度不均性, 进而影响颗粒在膜表面的吸附仍是不清楚的.

在本研究中, 采用石英电子微天平及耗散系数测量仪 (QCM-D) , 以正置 (Upright) 与倒置 (Inverted) 实验考察了在不同溶液高度, 生物膜对三种金纳米棒的吸附行为. 发现重力使金棒产生溶液分布的不均性; 长宽比影响了金棒的流体力学尺寸和浓度不均程度, 是调节金棒吸附量的重要因素. 研究深化了纳米颗粒与生物膜作用机制的理解.

2 实验部分

2.1 实验材料

二油酰基磷脂酰胆碱 (DOPC) 购于Avanti Polar Lipids. 三羟甲基氨基甲烷盐酸盐 (Tris) 购于Sigma. 氯金酸 (HAuCl4) 、十六烷基三甲基溴化铵 (CTAB) 、硼氢化钠 (NaBH4) 、硝酸银 (AgNO3) 、抗败血酸 (AA) 等购于国药集团. 实验用水通过Milli-Q超纯水系统净化 (电阻>18.2 MΩ.cm) .

2.2 金纳米棒的制备

通过种子法制备了三种金棒[8]. 在22.5 mL CTAB (0.1 M) 溶液中加入0.75 mL HAuCl4(0.01 M) 与1.8 mL NaBH4(0.01 M) . 快速搅拌反应2小时, 生成种子. 将50 mL CTAB (0.1 M) , 2.448 mL HAuCl4 (0.01 M) , 1 mL H2SO4(0.5 M) 与不同体积的AgNO3(0.01 M) 混合获得生长溶液. 加入0.4 mL AA (0.1 M) 与0.12 mL种子搅拌均匀, 静置过夜生成金纳米棒. 金棒采用离心清洗3次. 形貌通过透射电镜 (JEOL JEM-2100) 表征, 吸收光谱通过单光束紫外可见光光度计 (菁华759S) 表征, 金浓度通过电感耦合等离子体发射光谱仪 (PE Avio500) 表征. 在实验前将金棒超声稀释至Tris-HCl缓冲液 (10 mM Tris, 50 mM NaCl, pH 7) , 获得0.01 mg/mL的样品溶液.

2.3 支撑膜的制备

通过小囊泡在衬底的自发融合制备支撑膜[9]. 首先, 在烧杯中加入DOPC氯仿溶液, 氮气吹干并真空干燥6小时, 形成磷脂干膜. 随后, 在烧杯中加入Tris-HCl缓冲液, 室温水化3小时, 形成多层囊泡悬浊液. 再使用挤出器 (100 nm孔径滤膜) 反复挤压样品生成单层小囊泡. 最后, 将QCM-D的二氧化硅衬底芯片浸于囊泡溶液中, 自发融合形成DOPC支撑膜.

2.4 QCM-D的正、倒置实验

QCM-D (E1 Qsense) 通过共振频率峰偏移量 (Δf) 与耗散系数 (ΔD) 表征吸附层的质量 (Δm) 与粘滞性. 基于Sauerbery关系[6], Δm与Δf成正比:

Δm=-C·Δf/n

(1)

其中C为质量敏感常数,n为协频数. 吸附层的粘滞性越高, ΔD越大. 在正置实验中, 将QCM-D舱室正立放置, 芯片与支撑膜处于溶液底层. 在倒置实验中, 将舱室倒立放置, 芯片与支撑膜处于溶液顶层. 具体实验步骤如下: 泵入缓冲液, 待QCM-D基线稳定后, 加入囊泡自发融合形成磷脂支撑膜. 缓冲液冲洗后, 缓慢泵入金纳米棒溶液3 min. 随后关闭蠕动泵, 产生静置的溶液环境.

3 结果与讨论

3.1 金纳米棒与支撑膜的表征

通过种子法制备了三种金棒. 采用透射电镜表征了金棒的尺寸与形貌. 如图1abc与表1所示, 在生长溶液中添加0.15、0.375、0.75 mL AgNO3分别产生了长宽比 (L/R) 为1.6、2.8、7.1的棒状结构 (简称短棒ShortNR、中棒MiddleNR、长棒LongNR) . 图1d给出了它们的吸收光谱. 两消光峰由短轴、长轴的等离子体共振产生[10]. 随着L/R的逐渐增大, 两消光峰的间距由85、228扩大至363 nm. 并且, 由于生长溶液中过量的AA完全还原了AuCl4-[8], 单个种子成长获取的金原子数相近, 产生的三种金棒质量(mAu)相似 (表1) .

表1 金纳米棒的物理性质

采用QCM-D表征了DOPC囊泡在二氧化硅衬底的组装动力学. 如图1e所示, 正、倒置实验获取的实验曲线相似. 最初Δf降低ΔD提高, 表明高耗散的囊泡吸附; 随后Δf升高ΔD降低, 说明囊泡破裂释放水, 形成低耗散的支撑片层膜; 最终Δf与ΔD稳定在约-25 Hz、0.5 × 10-6, 表明形成了完整的支撑膜[11].

图1 金纳米棒与支撑膜的表征. (a) 短棒、(b) 中棒、(c) 长棒的透射电镜图. 标尺为100 nm. (d) 金棒的紫外可见吸收光谱. (e) QCM-D表征囊泡自发融合形成支撑膜.

3.2 金纳米棒吸附的表征

使用QCM-D表征了金棒在支撑膜表面的吸附. 在正、倒置实验中, 金棒溶液的浸泡均造成了Δf的显著降低与ΔD的略微提高 (图2ab) , 说明强刚性的金棒吸附至支撑膜表面. 基于Sauerbery关系统计了1 h吸附的金棒质量 (图2c) . 在正置实验中, ΔmlongNR<ΔmmiddleNR<ΔmshortNR, 即L/R较小的金棒吸附量较高. 这与Crespy、Paul等基于颗粒内吞的研究结果是一致的, 他们将此归因于长棒的高曲率不利于生物膜的吸附与包裹[12, 13]. 但在倒置实验中, ΔmmiddleNR<ΔmlongNR<ΔmshortNR, 即L/R适中金棒产生了最高的吸附量. 因此, 正、倒置实验获得了不一致的金棒长宽比与吸附量排序关系. 定义了正、倒置实验给定金棒的吸附差异d以进一步对图2bc分析：

(2)

其中Δmu、Δmi分别表示正、倒置实验测得吸附金质量. 如图2d所示, 首先d恒为正值, 表明每种金棒的正置实验吸附量始终大于倒置实验吸附量. 其次,d均随时间成长, 说明正、倒置实验的吸附差异是逐渐产生的. 更为重要的是, 在任一时刻dlongNR

图2 金纳米棒在支撑膜表面的吸附. (a) 正置实验; (b) 倒置实验; (c) 培养1 h的金棒吸附质量; (d) 正、倒置实验的吸附差异d.

3.3 正倒置实验差异的分析

对正、倒置实验中金棒吸附的差异根源进行分析, 并讨论金棒长宽比对此差异的影响来理解上述结果. 由于正、倒置实验中, 金棒与磷脂膜的范德华和静电等作用不变, 但重力驱动金棒运动的方向反转. 因此, 吸附差异应源于重力产生的金棒浓度不均性 (图3a) . 相较于理想的均匀分布的样品, 重力使底层的金棒浓度提高, 增大了正置实验的吸附量; 但也降低了顶层的金棒浓度, 减小了倒置实验的吸附量. 因此, 实验获得的d总是大于零 (图2d).

从自由能角度, 金棒向底部沉淀是重力势能最小化的结果, 但它的局域富集不利于体系熵的最大化. 两者的竞争造成了金棒的平衡不均分布[14]. 由于金棒的实验浓度较低 (体积占比约5 × 10-7) , 可用气体模型描述它在溶液高度z的平衡浓度c(z)[15]:

c(z)=c0exp(-zmbg/kBT)

(3)

其中c0为归一化的浓度常量, g为重力加速度, kB为玻尔兹曼常数,T为绝对温度,mb为浮力质量[6]:

mb=(ρAu-ρBuffer)mAu/ρAu)

(4)

其中ρAu、ρBuffer分别为金与缓冲液的密度. 将表1数据代入式3、4可得, 短棒、中棒、长棒在给定溶液高度的平衡浓度是基本相同的, 顶层比底层的平衡浓度高一个量级 (图3b) . 但是, 平衡不均分布是重力引起金棒再分布的极端情形, 需要消耗时间以达到该平衡[14, 15]. 基于stokes关系, 再分布消耗时间 (teq) 可由下式计算[15]:

(5)

其中η是缓冲液粘滞性,D为流体力学直径. 对于棒状粒子[16]:

(6)

图3c给出了三种金棒的D与teq.teq都达到小时量级, 表明金棒的不均再分布过程较为缓慢, 因此在实验中观测到了长时间增长的d(图2d) . 同时,teq随着金棒L/R值的增大而提高 (图3c) , 说明金棒长宽比可通过影响的流体力学尺寸D, 调节再分布消耗时间. 长棒具有较高的流体力学尺寸, 再分布消耗时间长, 保持了较均一溶液浓度, 因此正、倒置实验吸附差异低. 而短棒具有较小的流体力学尺寸, 再分布消耗时间短, 迅速地形成了不均匀的溶液分布, 因此正、倒置实验吸附差异大 (图2d) . 最后, 由于短棒、中棒、长棒浓度不均程度的差异, 导致了它们在不同溶液高度吸附量排序的变化, 即正、倒置实验中观测到的不一致的金棒长宽比与吸附量排序关系 (图2c) .

图3 (a) 正、倒置实验中支撑膜表面金棒吸附差异的示意图. L/R小的金棒, 更迅速实现非均分布, 顶、底层支撑膜吸附差异大; L/R高的金棒, 溶液浓度保持较均一, 顶、底层支撑膜吸附差异小. (b) 在QCM-D舱室中 (高度约1 mm) , 三种金棒的平衡浓度c(z) . (c) 三种金棒的流体力学直径D与再分布消耗时间teq.

4 结 论

在本研究中, 探索了纳米颗粒在重力场下支撑膜表面吸附中的形状效应. 发现, 金棒的长宽比影响了重力产生的浓度不均性. 对于L/R值大的金棒, 再分布消耗时间长, 能够长时间维持溶液浓度的均一, 有助于保持不同溶液高度吸附量的一致. 由于不同L/R产生了浓度不均程度的差异, 在溶液底层短棒的吸附量最大, 在溶液顶层中棒的吸附量最大. 研究为金纳米棒的生物医学应用提供了参考.