溃疡性结肠炎基因工程动物模型的研究进展

赵述芳，龚建萍，李 倩，沈志强

(昆明医科大学药学院暨云南省天然药物药理重点实验室，云南 昆明 650500)

近年来，随着经济条件的不断改善，人们的饮食结构和生活习惯也在不断改变，溃疡性结肠炎(UC)的发病率明显提高。UC是炎症性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)的一种，又称为非特异性溃疡性结肠炎，另一种典型的炎症性肠病是克罗恩病(CD)，两者均是以肠黏膜的慢性和间歇性炎症为特征[1-3]的原发性慢性胃肠道复发疾病。UC发病率远远高于CD，临床以腹泻、黏液脓血便、腹痛、里急后重、发热等为主要症状。该病大多数病程缓慢,有反复发作倾向,少数病例会急性暴发,病情凶险。由于该病的这些特点，目前还不能复制出一个完全符合人类UC发病机制及临床表现的实验动物模型。然而其发病原因涉及环境、遗传、免疫及炎症介质等因素[4-5]，并且因其具体病因、发病机制、疾病发展规律等尚不明确而被认为是胃肠道最严重且难治的疾病之一。因此急需一个完全符合人类UC发病机制及临床表现的理想实验动物模型来对这些方面进行深入的研究。目前建立UC实验动物模型的方法较多，根据模型建立的机制，大致可以分为化学诱导模型、细胞或组织过继转移模型、复合模型、中医模型和基因工程模型五大类。化学诱导模型因为操作简便而应用最广泛[6]，复合模型和细胞或组织过继转移模型是目前比较经典的造模方法，但随着对UC的深入研究，逐渐发现UC是一种与多基因密切相关的疾病[7-8]，因此，UC的基因工程动物模型备受关注。与前四类UC动物模型相比，基因工程模型成本高，造模条件和技术要求更高，但因其通常是对特定的一个或若干个基因进行修饰，具有极强的针对性，从而在阐明相关基因在疾病发病机制、疾病发展规律中作用时具有极大的优势，这对未来UC的进一步深入研究具有重大意义。UC的基因工程动物模型大致分为基因敲除模型和转基因模型[9]以及基因工程复合模型3种，现将这三类UC的基因工程动物模型的研究及进展做一综述。

1 基因敲除模型

基因敲除模型分为传统基因敲除模型和条件性基因敲除模型2种[10]。传统基因敲除模型是现有的基因被灭活或用人造DNA片段代替待敲除的目的基因的方法来建立模型。而条件性基因敲除模型是从身体的单个器官敲除特定的基因来建立的模型[11]。总之两种方法均使特定的基因缺失，从而产生肠道炎症。

1.1白细胞介素-10(IL-10)基因敲除模型 IL-10由T细胞、B细胞和巨噬细胞等产生，它能抑制巨噬细胞产生炎性细胞因子，如白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α),抑制辅助性T细胞1(Th1)、自然杀伤细胞(NK)和巨噬细胞的功能[12]。因此IL-10-/-的小鼠导致CD4+Th1细胞的激活以及降低了它们的抑制因子调节性T细胞的水平，导致了炎症的发生[13-14]。IL-10-/-小鼠自发地在整个肠段发生慢性炎症，但主要发生在十二指肠、空肠近端和升结肠。由于结肠炎的发展是可预测的，该模型可用于研究结肠炎不同阶段血清和肠道蛋白的性质，寻找IBD的疾病标志物，并研究饮食对炎症的影响[15]。此外，由于结肠炎只有在接触共生菌后才会发生，这个模型对于研究结肠上皮和肠道微生物区系之间复杂的相互作用是有用的。

1.2多药耐药蛋白1a缺失模型(Mdr1a) Mdr1a基因是小鼠多药耐药1a基因，该基因参与上皮细胞通透性的调节[16]。该基因缺失，上皮细胞通透性增加，紧密连接蛋白磷酸化降低，导致炎症的发生。在常规饲养的情况下，Mdr1a-/-小鼠在5～8周龄[17]时可发展为自发性的、菌群依赖的结肠炎[15]。组织病理学改变类似于UC，其病理与人类CD相似，且炎性结肠组织的基因表达变化与IBD患者的基因调控重叠[18]，为研究肠上皮屏障功能、免疫调节、感染性共触发因素和新的治疗方法提供了一个很有价值的IBD模型[19]。此外，该结肠炎是在接触共生菌后发生的，该模型也可以研究微生物区系与IBD发病机制之间的相互作用。

1.3黏蛋白2缺失模型(Muc2) 通常认为，UC发病与正常结肠黏膜屏障的结构或功能缺陷有关。正常结肠黏膜屏障主要成分是杯状细胞释放的Muc2[20]，它是一种高度糖基化的蛋白质，一旦释放，它就会水合，形成黏液层，防止微生物和管腔抗原接触上皮表面[21]。有研究表明，UC患者结肠组织出现杯状细胞数量减少，黏液层比正常黏液层薄的现象。同样的，缺乏Muc2或Muc2错义突变损害其释放和功能的小鼠，在3个月大的时候发展为自发性结肠炎[20]，引起以肠上皮细胞扁平和溃烂为特征的异常形态，炎症细胞轻度浸润，增殖增加，结肠细胞分化减少，小鼠结肠组织中白细胞介素-1β(IL-1β)表达上调。尽管杯状细胞产生的黏膜防御因子抵抗素样分子-β(RELM-β)也急剧上调[22]，但其在特定微生物群存在下可能会导致不同严重程度的结肠炎[23]。

Muc2-/-小鼠结肠炎模型可从多个方面来研究上皮屏障的生理作用以及屏障功能受损在UC发病、发展中的作用，并为通过降低肠道屏障功能的损害和限制免疫反应来实现黏膜免疫稳态的UC治疗方法的相关研究提供了一个有价值的动物模型[24]。

1.4TRUC(T-bet-/-×RAG2-/-ulcerative colitis)模型 由于先天和适应性免疫的遗传缺陷，TRUC模型(T-bet-/-×RAG2-/-)小鼠在3周龄之前表现出结肠炎的体征，然后逐渐发展为早期发作的自发性溃疡性结肠炎[25]。其发病机制[26]是T-bet-/-小鼠通过模式识别受体(PRRs)信号激活的树突状细胞释放TNF-α、IL-1和IL-23。IL-23和IL-1共同刺激先天性淋巴细胞(ILCs)分泌IL-17A。TNF-α可以诱导结肠上皮细胞凋亡[27]，且与IL-17A具有协同作用，促进中性粒细胞的产生，中性粒细胞释放的组织损伤介质加剧了TRUC小鼠的结肠屏障功能障碍。此外，该模型结肠炎的发生还依赖于肠道微生物组。在无菌条件下的TRUC小鼠不会发展为结肠炎，只有在肺炎克雷伯菌和奇异变形杆菌等特定的肠道微生物存在的情况下才会引发TRUC结肠炎[28]。TRUC小鼠的自发性结肠炎在许多方面类似于人类UC。炎症主要发生在远端，仅限于黏膜或黏膜下层，并与上皮异常增生和结直肠癌的高发有关[26]。

TRUC小鼠为评估肠道微生物群在结肠炎发病机制中的作用以及表征肠道微生物群对治疗干预的反应提供了一种易于处理的模型[25]。此外该模型还可用于研究固有免疫和适应性免疫与UC发病机制的相关性。

1.5信号转导和转录激活因子3缺失模型(Stat3)Stat3是信号转导和转录激活因子3，是CD和UC的易感基因[29]，它是控制Th17分化和上皮再生等广泛适应性和先天免疫反应的主要转录因子。Stat3在IL-10介导的髓样细胞信号通路中起着关键的作用，Stat3缺失小鼠的巨噬细胞没有表现出任何由IL-10介导的抗炎反应[30]。此外，有研究表明，尽管CD4+T细胞中Stat3的激活诱导了结肠炎的发生[31-32]，但巨噬细胞或中性粒细胞特异性的Stat3敲除小鼠在20周龄时自发地患上了结肠炎，在没有T细胞和B细胞的情况下巨噬细胞或中性粒细胞特异性Stat3敲除小鼠又不会导致结肠炎的发生[33]。此外，上皮细胞中Stat3的特异性缺失也未能导致自发性结肠炎[33]。这些发现提示Stat3介导的获得性免疫激活在结肠炎中起致病作用，而Stat3介导的天然免疫激活在结肠炎中起保护作用。

该模型可用于研究转录因子在肠道中的生物学功能以及研究Stat3基因在结肠炎中的作用，为进一步研究UC的发病机制和治疗手段提供一定的指导意见。

2 转基因模型

与基因敲除模型不同，UC转基因模型是将目的基因拷贝，从而导致特定基因的过度表达[10]。与基因敲除模型类似，转基因模型也有传统转基因模型和条件性细胞特异靶向转基因模型2种。

2.1白细胞介素-7(IL-7)转基因模型 IL-7具有调节黏膜淋巴细胞作用，对胸腺T细胞的分化增殖有影响。IL-7转基因模型中IL-7过度表达，从而激活大量黏膜淋巴细胞，小鼠在4～12周龄左右自发发展为结肠炎[33]。该模型是一种传统转基因模型，IL-7转基因小鼠结肠黏膜 IL-7 mRNA的过度表达，导致肠道中CD4+T细胞和中性粒细胞浸润[33]。该模型适合用于T细胞介导的结肠炎发病机制以及针对T细胞功能治疗干预UC的相关研究[10]。在组织病理学上与人类UC相似，是研究疾病的良好的工具和载体，但是转基因模型的建立同样具有相当的技术难度，成本较高。

2.2人类白细胞抗原B27(HLA-B27)转基因模型HLA-B27转基因模型是通过在大鼠或小鼠基因组中插入HLA-B27的基因而培育出来的，HLA-B27是一种人类I类主要组织相容性等位基因，参与抗原呈递，可自发引起慢性胃肠道炎症、关节炎、强直性脊柱炎等炎症。HLA-B27转基因模型表达人类β2微球蛋白和组织相容性基因HLA-B27，自发地产生免疫介导的肠道慢性炎症，是公认的IBD动物模型[34]。

HLA-B27转基因模型产生的主要是Th1炎症反应，与CD相似，而其结肠炎的组织学特征与UC非常相似[34]。HLA-B27转基因模型常用于研究肠道常驻细菌对胃肠道炎症的急性和慢性阶段的作用[10]。

2.3血清反应因子(Srf)转基因模型 Srf是一种被各种细胞外刺激激活的转录因子，过度表达Srf的小鼠表现出多种病理特征，包括UC样症状和胰腺上的生化样表型[35-36]。Ikeda等[37]采用多西环素(Dox)诱导系统，在胚胎干细胞系(ESCs)的Col1a1位点(在Rosa26中携带M2-rtTA)中引入了Dox调节的Srf，然后引入了res-mCherry，并将建立的细胞注射到ICR小鼠囊胚中，以产生嵌合小鼠。将4周大的具有类似嵌合体的小鼠给予2 μg/mL的Dox处理4 d或7 d，然后进行Srf过表达的观察和表型诊断。结果发现，该模型与人类UC十分类似，肠道炎症细胞浸润，导致结肠内上皮脱落和隐窝脓肿，且病变部位与表达异常的Srf区域一致，并提示Srf过表达可能参与溃疡性结肠炎的病理过程[37-38]。因此，该模型可作为研究UC疾病发病机制、疾病发展进程的动物模型。

3 基因工程复合模型

基因工程复合模型是以基因工程动物为基础，再与其他手段相结合，从而产生更符合研究目的、更具有针对性的动物模型。

3.1葡聚糖硫酸钠(DSS)复合N-乙酰氨基葡萄糖-6-O-磺基转移酶1，2(GlcNAc6ST-1，-2)双重敲除模型 Low等[39]选用8周龄GlcNAc6ST-1-/-×GlcNAc6ST-2-/-雄性小鼠与其C57BL/6野生型小鼠产幼鼠。接着将得到的双重基因敲除小鼠饲养在无特定病原体(SPF)的条件下，自由饮用2%的DSS 1周，再饮用水1周，总共持续6周便可建立类似人UC的实验性结肠炎模型。在DSS的作用下，野生型小鼠和双重缺失 GlcNAc6ST-1和GlcNAc6ST-2的小鼠均表现出活动性结肠炎的体征，包括活动性降低、驼背、腹泻和便血。组织学表现也与人类UC相似，出现隐膜炎、隐窝脓肿，甚至在结肠的远端至中间部位出现溃疡性病变。但相比于野生型小鼠，双重缺失GlcNAc6ST-1和GlcNAc6ST-2的小鼠产生更严重的结肠炎，出现更多的溃疡性病变，结肠固有层的多形核细胞浸润程度更深，是一个与人类UC相似的实验结肠炎模型，可用于UC的相关研究。此外，一般认为UC的炎症细胞是通过高内皮微静脉(HEV)样血管招募的,而N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)的6-O-硫酸化与HEV样血管的作用有关，且GlcNAc6ST-1和GlcNAc6ST-2是GlcNAc的6-O-硫酸化反应的唯一催化剂[40]。因此，使用GlcNAc6ST-1和GlcNAc6ST-2双重缺陷的小鼠的该模型可用于研究GlcNAc的6-O-硫酸化对UC中HEV样血管的作用[40]，为进一步研究UC的炎症机制、发病机制、疾病发展以及诊断治疗方法提供一定的指导意见。

3.2IL-10受体中和抗体(IL-10R mAb)复合Toll样受体(TLRs)敲除模型 Carvalho等[41]分别建立了IL-10R mAb复合TLR5-/-,IL-10R mAb复合TLR4-/-/TLR5-/-和IL-10R mAb复合Re-TLR5-/-三种结肠炎的动物模型。前两种模型是将6～8周的TLR5-/-、TLR4-/-/TLR5-/-小鼠分别与C57BL/6小鼠回交至10代，然后每周按照1 mg/只的剂量给小鼠腹腔注射IL-10R mAb，连续4周[41]。在第5周后便能检测到结肠炎，模型即被建立。

IL-10R mAb复合Re-TLR5-/-模型是先将雄性TLR5-/-小鼠与野生雌性C57BL/6J小鼠进行繁殖。将胚胎移植给代孕C57BL/6J小鼠，产生再衍生的TLR5杂合子小鼠(Re-TLR5-/-)，以获得与C57BL/6J小鼠具有相同或相似肠道菌群的TLR5-/-小鼠[42]。后续操作同前两种模型，同样到第5周结肠炎模型即可建立。

TLR5-/-和Re-TLR5-/-小鼠在用IL-10 RmAb处理后均出现了结肠炎。IL-10R mAb复合TLR5-/-模型呈现出结肠肿大、增厚、出血，脾肿大，粪便松散等特点。且组织病理学特征为隐窝脓肿和隐窝变形或丢失。但IL-10R mAb复合Re-TLR5-/-模型使用了Re-TLR5-/-小鼠后可显著减轻其自发性结肠炎，但仍具有低度炎症和代谢综合征的特征[42]。TLR5-/-小鼠自发性结肠炎的程度与其菌群的组成有关，使用Re-TLR5-/-小鼠便可获得与特定的小鼠具有相同或相似肠道菌群的TLR5-/-小鼠[42]。

像TLR5-/-小鼠一样，TLR4-/-/TLR5-/-小鼠在IL-10R被阻断2周后体重开始减轻。组织病理学方面，小鼠表现出隐窝变形，溃疡和中性粒细胞广泛浸润到浆膜中。TLR4信号转导可增加促炎信号转导,TLR4缺失便可减少促炎信号的转导，促炎信号转导减少至一定程度可以预防TLR5缺失的小鼠发展为自发性结肠炎，但用IL-10 RmAb处理后，由于干扰其内源性抗炎机制，因此会表现出严重的结肠炎[41]。

Carvatho等[41]在3种模型中观察到IL-10R功能阻断会使TLR5-/-小鼠诱发结肠炎，而IL-10R功能的阻断与肠道菌群组成的改变有关。另外，他们还发现阻断IL-10信号后，TLR5缺失的小鼠易患由IL-1β依赖的免疫失调所引发的结肠炎。因此通过这3个模型，可以进一步研究结肠炎中肠道菌群组成与IL-10、 IL-1β之间的关系，以及肠道菌群组成、IL-10、 IL-1β在结肠炎中的作用，进而为结肠炎的诊断和治疗提供新的思路。

3.3他莫昔芬复合kindlin 1/kindlin 2双重敲除模型 先前有研究表明UC的一个重要发病特征是固有的黏液磷脂酰胆碱(PC)含量低[43]。Stremmel等[44]为了研究UC中固有的PC含量低是否与细胞旁运输的紧密连接(TJs)缺失有关，建立了他莫昔芬复合kindlin 1/kindlin 2双重敲除模型。kindlin 1和kindlin 2可以激活整合素，促进细胞黏附到基底膜或细胞与细胞的连接处[45]。该模型长时间暴露于他莫昔芬后，由于黏膜缺损，便可建立成熟的UC表型。他们利用12周龄、体重约31 g的肠道特异性缺失villin-Cre依赖的kindlin 1和2的小鼠，每天9：00按照0.2 mg/只的剂量给小鼠腹腔注射他莫昔芬，持续3 d即可建立UC模型[44]。在暴露于他莫昔芬2 d后，并未出现显著的炎症，但在电镜下均发现TJ形态缺陷。第3天后，该模型在回肠和结肠中出现了类似于UC表型的明显黏膜炎症，粪便无定形、黏稠且含有血液，组织学呈现出结肠溃疡和水肿，隐窝结构、黏膜和黏膜下层炎症以及嗜中性粒细胞和淋巴细胞浸润。最后，他们证明了他莫昔芬复合kindlin 1/kindlin 2双重敲除模型导致TJ缺失，TJ破坏导致PC含量降低，因此黏液PC分泌受损是UC的病理生理特征，并导致与人UC相似的黏膜炎症[44]。这种新的UC基因工程复合小鼠模型类似于人的UC病理生理学，因此可用于进一步的实验研究。

4 小 结

超过400万人受到IBD的困扰，尽管过去十年来在发病机制、治疗方面都取得了一些进展，但目前UC的确切发病机制并未完全阐明，而且UC的一线治疗仅限于免疫抑制和抗炎药物，因此仍需在这些方面进行进一步的研究，而进行相关研究就需要一个理想的UC动物模型。

在过去的几十年里，已经发展出几十种不同的IBD动物模型。虽然它们在研究疾病发生和转归的潜在机制时具有巨大的价值，也为研究各种因素参与IBD的发病机制和评估不同的治疗策略提供了广泛的选择。但人类UC特别复杂，这些模型通常并不代表人类疾病的复杂性，不能全面地模拟人类UC的病情，在研究中常常缺乏合适的UC模型。因此，还需对UC基因工程动物模型进行进一步深入的研究。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。