当归饮子对血虚风燥型皮炎-湿疹表皮通透屏障功能障碍调控机制研究

贺 乙，范丽娜，武亦阁，周 光

(新疆医科大学，新疆 乌鲁木齐 830011)

湿疹是由多种内、外因素引起的一种炎症性、变态反应性皮肤病，皮疹好发于手足、小腿、肘窝、肛门等处，多对称发病。慢性湿疹常由急性湿疹及亚急性湿疹迁延而来，临床表现为丘疹、鳞屑、苔藓样变伴阵发性的剧烈瘙痒等，呈反复发作，影响患者的生活质量。目前研究认为湿疹发病与表皮通透屏障功能障碍有关[1]，表皮通透屏障功能破坏，皮肤“砖墙结构”不稳定,经表皮水分流失量增加，皮肤则出现干燥、脱屑。慢性湿疹在中医学中属于“湿疮”范畴，根据其临床表现辨证为血虚风燥证。当归饮子出自《济生方》，是治疗血虚风燥证皮肤病的代表方剂。钱轶雯等[2]研究证实，当归饮子能够有效改善血虚风燥型湿疹患者皮损状态，减轻瘙痒程度。本实验通过建立血虚风燥型皮炎-湿疹样病变豚鼠模型，旨在探讨当归饮子对表皮通透屏障功能的调控机制。

1 实验材料与方法

1.1实验动物 普通级健康雄性DH豚鼠32只，体重(350±20)g，购自陕西君行生物科技有限公司，动物合格证号：SCXK(陕)2017-001。饲养于新疆医科大学动物中心普通级环境实验室，温度20～26 ℃，相对湿度10%～25%,光照节律12L∶12D。本实验已通过新疆医科大学第一附属医院动物伦理委员会审查(IACUC-20160218-076)。

1.2主要药物 当归饮子组方：当归10 g、白芍10 g、川芎10 g、生地黄10 g、白蒺藜10 g、防风10 g、荆芥10 g、何首乌5 g、黄芪5 g、炙甘草5 g、生姜3 g。饮片购自新疆医科大学第四附属医院，由中药师进行药材真伪鉴定。中药常规煎煮2次，合并滤液，95 ℃水浴浓缩后4 ℃冰箱保存备用。氯雷他定片(海南新世通制药有限公司，国药准字H20041886)。给药剂量根据成人与豚鼠体表面积比例进行换算。

1.3主要试剂及仪器 2，4-二硝基氯苯(上海古朵生物科技有限公司，批号：20191210)，丙酮(天津富宇精细化工有限公司，批号：20190608)，豚鼠血清白细胞介素-4(IL-4，货号：YX-E28700，批号：20200130)、白细胞介素-17(IL-17，货号：YX-E28700，批号：20200130)、CD4+(货号：YX-E28758，批号：20200130)、CD8+(货号：YX-E28799，批号：20200130)、免疫球蛋白E(IgE，货号：YX-E28996，批号：20200130)ELISA检测试剂盒购自上海江莱生物科技有限公司，苏木素伊红(HE)染色液(LEAGENE公司，批号：0611A20)。多功能皮肤测试仪(德国CK公司， MPA6/10型)，台式低速离心机(上海菲恰尔分析仪器有限公司，SF-TDL-5C型)，分析天平(德国Sartorius公司，BL310/BL21S型)，电子天平(上海菁海仪器有限公司，DY15K型)，光学显微镜(德国Leica公司，DM2500型)。

1.4实验方法

1.4.1溶液的制备方法 致敏及激发溶液的制备:精密称取2，4-二硝基氯苯3.50 g，用50 mL丙酮溶解，制成7%的2,4-二硝基氯苯丙酮溶液作为实验的致敏溶液；精密称取2，4-二硝基氯苯0.10 g，用100 mL丙酮溶解，制成0.1%的2,4-二硝基氯苯丙酮溶液作为实验的激发溶液。

1.4.2动物分组、造模及干预 豚鼠适应性喂养1周后，按随机数字表法分为正常组、模型组、氯雷他定组和当归饮子组，每组8只。除正常组外，其余组参考文献[3]方法造模：豚鼠背部脱毛3 cm×3 cm大小以暴露皮肤,实验第1天以7%致敏溶液100 μL外涂背部脱毛区致敏,第5天外涂0.1%激发溶液25 μL于豚鼠左耳内侧激发，每周重复上述操作1次,共致敏、激发各4次。造模4周结束后，豚鼠背部致敏区皮肤出现红斑、丘疹、苔藓样变并伴明显搔抓现象，左耳局部明显潮红或有少量白色细碎鳞屑提示模型建立成功。实验第29天开始，当归饮子组给予当归饮子水煎浓缩液6.82 g/kg(浓度1.36 g/mL)灌胃，氯雷他定组给予氯雷他定0.80 mg/kg(浓度0.16 mg/mL)灌胃，正常组和模型组给予相应体积生理盐水灌胃，均1次/d，连续14 d。

1.5观察指标及方法

1.5.1皮肤组织病理观察 灌胃结束后，取豚鼠背部致敏区皮肤组织(正常组取相应背部皮肤组织)，甲醛固定，石蜡包埋,制成5 μm厚薄层切片，常规HE染色,光学显微镜下观察。

1.5.2皮损评分 分别于造模结束当日和灌胃结束当日进行皮损评分,评分标准参考文献[4]。红斑：无为0分，轻微为1分，明显红斑无痂皮为2分，中度红斑伴轻中度痂皮为3分，重度红斑伴重度痂皮为4分；水肿：无为0分，轻度为1分，中度为2分，重度为3分；抓痕：无为0分，有为1分。总评分为上述各项评分之和。

1.5.3皮肤角质层含水量及经表皮水分流失量检测 分别于造模前、造模结束及灌胃结束当日使用多功能皮肤测试仪进行检测。

1.5.4血清指标检测 灌胃结束后采用1%戊巴比妥钠麻醉各组豚鼠，腹主动脉取血约8 mL，3 000 r/min(离心半径16 cm)离心15 min，取上清液置于-80 ℃冰箱中，待用酶联免疫法测定血清IgE、IL-4、IL-17、CD4+、CD8+水平，操作严格参照试剂盒说明书进行。

2 结 果

2.1各组豚鼠皮肤组织形态比较 正常组豚鼠皮肤组织结构基本正常，皮肤表皮角质层、颗粒层、棘细胞层及基底细胞层结构完整，真皮层纤维排列整齐，未见水肿、出血及炎性细胞浸润等病理改变；模型组豚鼠皮肤表皮角化过度，颗粒层、棘细胞层及基底细胞层增生，真皮浅层大量密集分布嗜酸性粒细胞，真皮乳头水肿，纤维结缔组织轻度增生；氯雷他定组豚鼠皮肤表皮角质层轻度角化，棘细胞层增厚，真皮层少量炎性细胞浸润；当归饮子组豚鼠皮肤表皮趋于正常，颗粒层增生，真皮层少量炎性细胞浸润。见图1。

图1 正常组和皮炎-湿疹样病变各组豚鼠皮损区皮肤组织HE染色表现

2.2各组豚鼠皮损评分比较 造模后，各造模组豚鼠皮损评分明显高于正常组(P均<0.05)；灌胃结束后，模型组豚鼠皮损评分明显高于正常组(P<0.05)，氯雷他定组和当归饮子组均明显低于模型组(P均<0.05)，当归饮子组与氯雷他定组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 正常组和皮炎-湿疹样病变各组豚鼠皮损评分比较分)

2.3各组豚鼠皮肤角质层含水量比较 造模前，各组豚鼠皮肤角质层含水量比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。造模后，各造模组豚鼠皮肤角质层含水量均明显低于正常组(P均<0.05)，各造模组间比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。灌胃结束后，模型组豚鼠皮肤角质层含水量明显低于正常组(P<0.05)，氯雷他定组和当归饮子组均明显高于模型组(P均<0.05)，且当归饮子组明显高于氯雷他定组(P<0.05)。见表2。

表2 正常组和皮炎-湿疹样病变各组豚鼠皮肤角质层含水量比较

2.4各组豚鼠经表皮水分流失量比较 造模前，各组豚鼠经表皮水分流失量比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。造模后，各造模组豚鼠经表皮水分流失量均明显高于正常组(P均<0.05)，各造模组间比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。灌胃结束后，模型组豚鼠经表皮水分流失量明显高于正常组(P<0.05)，氯雷他定组和当归饮子组均明显低于模型组(P均<0.05)，且当归饮子组豚鼠明显低于氯雷他定组(P<0.05)。见表3。

表3 正常组和皮炎-湿疹样病变各组豚鼠经表皮水分流失量比较

2.5各组豚鼠血清IgE、IL-4、IL-17、CD4+、CD8+水平比较 模型组豚鼠血清IgE、IL-17、CD8+水平均明显高于正常组(P均<0.05)，血清IL-4、CD4+水平均明显低于正常组(P均<0.05)；氯雷他定组和当归饮子组豚鼠血清IgE、IL-17、CD8+水平均明显低于模型组(P均<0.05)，但当归饮子组均明显高于氯雷他定组(P均<0.05)；氯雷他定组和当归饮子组豚鼠血清IL-4、CD4+水平均明显高于模型组(P均<0.05)，但当归饮子组均明显低于氯雷他定组(P均<0.05)。见表4。

表4 正常组和皮炎-湿疹样病变各组豚鼠血清IgE、IL-4、IL-17、CD4+、CD8+水平比较

3 讨 论

表皮通透屏障功能障碍常表现为皮肤水分过度流失导致皮肤外观呈干燥脱屑状态，同时促进表皮增生以及某些炎症因子的释放[5]。周光教授从中医角度分析认为皮毛“疏泄”功能障碍和“润泽”状态改变在皮肤病证候与病机方面具有普遍性和特征性[6]。基于脏腑营卫脉络表里相关整体性理论，诸多名家医案立法与组方用药在皮肤“疏泄”与“润泽”立法方面有明显的趋同性[7]。皮毛“疏泄”与“润泽”功能是皮毛“卫外”功能的具体反映形式和理论内涵，也是中医“皮毛微环境”的主要特征[8]。中医皮毛“疏泄”与“润泽”微环境功能与西医学表皮通透屏障功能有趋同性，表皮通透屏障功能障碍是许多皮肤病的共性机制[9]。基于《内经》“皮毛生

肾”理论，皮毛与肾的滋养有密切联系。一方面，肾精通过肾络供给皮肤营养以濡养皮毛；另一方面，元气是气之根本，卫气根源于肾，元气充足，皮肤卫外功能正常。慢性湿疹以瘙痒为主要临床表现，其发病主要因肝肾精血不足，经络不通，皮肤“疏泄”和“润泽”功能失调，肌肤失于濡养以致血虚风燥。

当归饮子具有滋补肝肾、养血润燥之功效。方中当归为君药，配伍生地黄、白芍、川芎、何首乌补益肝肾，疏通经络，养血润燥；荆芥、防风、白蒺藜辛散透表，疏泄皮毛；黄芪益气固表升阳，以助方中养血润燥之药达表，又可祛邪外出；甘草调和诸药。诸药配伍，补中有通，能够将肝肾之精经脏腑经络输送至肌表以濡养皮毛，改善“皮毛微环境”。

本研究用2,4-二硝基氯苯建立皮炎-湿疹豚鼠模型，HE染色显示皮肤表皮角质层角化过度，颗粒层、棘细胞层及基底细胞层增生，真皮浅层有大量嗜酸性粒细胞，真皮乳头水肿，纤维结缔组织轻度增生；豚鼠皮损评分升高。当归饮子组干预后，HE染色显示皮肤表皮角质层角化程度趋于正常，真皮层嗜酸性粒细胞浸润明显减轻；豚鼠皮损评分显著降低。提示当归饮子可以有效改善血虚风燥证皮炎-湿疹样豚鼠的皮肤状态及皮肤组织病理改变。

目前研究表明湿疹的发病、加重及预后延迟与表皮通透屏障功能障碍有密切联系[1]。皮肤角质层含水量及经表皮水分流失量是非侵入性测定表皮通透屏障功能的主要指标，能够灵敏反映皮肤屏障功能[10]。皮肤角质层含水量和经表皮水分流失量与湿疹严重程度相关[11]，经表皮水分流失量越高，说明角质层水量丢失越多，含水量越少，皮肤则呈干燥、脱屑状态[12]。本实验结果显示，当归饮子组豚鼠经表皮水分流失量明显低于模型组，皮肤角质层含水量明显高于模型组，结合皮肤病理和皮肤状态变化，推测当归饮子可以通过改善皮肤组织形态，从而减少经表皮水分散失，达到修复表皮通透屏障的作用。

随着对湿疹的研究深入，发现表皮通透屏障功能和机体免疫平衡有密切关系[13]。初始T细胞经刺激可分化为CD4+T细胞亚群和CD8+T细胞亚群，两者之间相互制约、协调来维持人体免疫稳态。若T淋巴细胞亚群比例失衡会导致免疫功能紊乱，血管扩张、血管壁通透性增加，从而产生皮炎-湿疹样病理改变[14]。CD4+T细胞又可分化为Th1、Th2细胞和Th17细胞。Th1/Th2的平衡失调是湿疹发生发展的原因之一，Th1细胞介导细胞免疫，Th2细胞分泌IL-4等介导体液免疫[15]。Th17/Treg的平衡失调也可能是湿疹发病的另一重要原因[16]。Th17细胞主要分泌IL-17细胞因子，IL-17刺激促炎性细胞因子及趋化因子的表达，增强B淋巴细胞活性，活化中性粒细胞，从而导致炎症反应。IgE 是过敏性疾病的重要标志物，其可直接作用并诱导Th2细胞活化分泌IL-4，IL-4又可进一步促进B细胞产生IgE[17]。本实验结果显示，模型组豚鼠血清IL-4、CD4+明显降低，IgE、IL-17、CD8+明显升高；当归饮子组血清IL-4、CD4+明显高于模型组，IgE、IL-17、CD8+明显低于模型组。表明当归饮子可调节T淋巴细胞亚群比例和IL-4、IL-17细胞因子水平，恢复机体的免疫平衡状态；可降低血清IgE水平，达到类抗过敏作用。

综上所述，当归饮子可通过改善皮肤组织形态而减少经表皮水分散失，可降低血清IgE水平达到类抗过敏效果，可改善CD4+、CD8+平衡状态及调节血清IL-4、IL-17细胞因子来修复表皮通透屏障，从而达到改善“皮毛微环境”状态。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。