碱基编辑技术的新进展及在耳蜗中的应用前景

潘豪来 倪丽艳 陈波蓓

大多数感音神经性聋与基因突变相关(Morton等，2006)， 基因靶向治疗似乎是一种更精确的治疗方式。CrispR/cas9系统已经超越锌指或TALLEN成为基因编辑首选[1]，但是会切除引导RNA配对的双链基因序列，剪切产生的双链DNA粘性断端诱导被编辑的细胞启动基因修复程序来修补这一缺损。然而诸如非同源断端连接或者同源基因引导修复均不能完美地将单碱基突变序列修复为野生型序列[2～5]。近年研究通过改进CrispR/Cas9技术，即在Cas9酶的基础上，融合1个碱基脱氨酶基团并降低Cas9酶中剪切酶的活性，研发一种酶可以人为诱导单个突变基因复原而不切除DNA双链，该项研究技术即为碱基编辑(base editing)[6]。腺苷酸碱基编辑酶(adenosine base-editing enzyme, ABE)和胞嘧啶碱基编辑酶(cytidine base-editing enzyme, CBE)是其代表，它们分别诱导A-T序列转化为G-C和C-G转化为T-A。碱基编辑能最大程度减小对目标碱基周围序列的损伤，其产物大多数情况下都可预测，因此它是治疗以单碱基突变且常染色体隐性遗传为主的遗传性感音神经性聋的合适措施。

理论上ABE和CBE能治愈超过60%的人类致病基因[7]。但在实际应用中，总会有非目标靶点的碱基修饰发生，即初代碱基编辑酶会无差别编辑前间区序列(protospacer)中约为4～5个碱基宽度的编辑窗口内的任意相邻腺苷酸或胞嘧啶脱氧核糖核酸[8,9]。因此，初代酶只能应用于前间区序列中仅有一个腺苷酸或胞嘧啶脱氧核糖核酸的情况。但大多数人类先天性感音神经聋致病基因中，都有数个腺苷酸或胞嘧啶脱氧核糖核酸位于前间隔序列编辑窗内。研究报道编辑非目标位点的碱基可能引起宿主破坏性的结果[10]。同时，碱基编辑需要目标序列周围存在前间隔序列临近序列(protospacer adjacent motif， PAM)。以初代CBE为例，若目标靶点周围没有序列为NGG的PAM，其编辑效率将极低。

提高碱基编辑的生物活性也是一大难题。目前不存在能完全纠正靶点的碱基编辑酶，且存在某一特定碱基编辑酶变体可能在某个位点表现活性较高，但是在另一位点作用时活性相对下降的情况。因此，对于碱基编辑酶的进一步研发升级，提高碱基编辑酶的精确性及生物活性是该项研究的主攻方向。本综述旨在介绍近期关于提高碱基编辑的准确性及效率的相关进展；同时由于耳蜗是一个相对孤立、与周围组织关联较少的器官；耳蜗注射基因编辑器也早已展开研究，本文将对碱基编辑在耳蜗基因突变疾病治疗中的应用前景展开综述。

1 最新进展

1.1噬菌体辅助连续进化器(phage-assisted continuous evolution, PACE) PACE最早应用于进化CrispR/Cas9体系，近期科学家们尝试将其应用于碱基编辑，即携带副质粒(accessory plasmid, AP)的大肠杆菌排列成队持续通过装有携带选择质粒(selection plasmid, SP)噬菌体的容器。SP中携带被需要的碱基编辑原件，只有噬菌体成功转染大肠杆菌，即SP转染AP，才能引起AP发生碱基突变，进而诱导宿主大肠杆菌增殖速度加快。被成功转染的大肠杆菌增殖速度大于大肠杆菌通过容器的速度从而被保留在容器中，几个周期后，容器中留下被纯化的转染后大肠杆菌[10]，其生产的碱基编辑酶能较完美地在后续特定碱基编辑条件下发挥作用。通过人工干预PACE的转染条件，不仅可提高碱基编辑的生物活性，还能扩充Cas9的应用范围，例如应用PACE技术产生的xCas9可识别的PAM不仅仅是NGG，其还能识别NG、GAA、GAT[11]，从原理上来说，不能再限制碱基编辑的应用范围。

在实际碱基编辑应用中，初代CBE的亚型APOBEC1在目标位点为TC时，编辑效率明显高于其他情况[8,12]。而通过PACE改造，善于编辑GC序列的编辑器得以诞生[10]。因此，可以预见今后碱基编辑技术的进一步改进升级将越来越依赖于强大的PACE技术。且PACE对实验室硬件要求低，未来若成功研发PACE商业试剂盒，将进一步简化并推广该技术。

1.2化学修饰 不同于PACE技术，人工干预直接修饰碱基编辑酶的氨基酸组成或蛋白结构同样能缩窄碱基编辑窗口或者提高编辑酶活性[12～14]。针对这一目的，近期研究尝试将一段富含脯氨酸的片段植入APOBEC1和nCas9之间[15](APOBEC1和CDA1均为编辑酶中负责碱基脱氨的基团)，这一操作能缩短两个基团之间的空间距离，从而使APOBEC1能更精确地绑定前间隔序列中的目标胞嘧啶[16]。然而相同策略应用于CDA1-BE却不能使编辑精确性提高。通过后期蛋白序列分析发现，在CDA1与nCas9基团之间存在一个核蛋白输出信号序列，该序列对碱基编辑毫无作用。据此，完全去除分割CDA1和nCas9之间的连接序列，CDA1的生物活性和编辑精确性均得到了提高(Patenaude等，2009)。

碱基编辑基团与nCas9基团之间的连接顺序也对碱基编辑系统的编辑效率产生影响。研究发现，将APOBEC1基团绑定在nCas9基团的N端时，整个碱基编辑系统的编辑效率大大提高。但是CDA1无论绑定在nCas9的C端或者N端，其编辑效率并无显著差异[15,16]。

碱基编辑酶诱导非目标tRNA序列突变是临床应用前需要攻克的一大难题[17,18]。它引起tRNA突变的可能原因在于ABE中的核苷酸脱氨酶基团是一个异质二聚体，由野生型tRNA脱氨酶单体与修饰后tRNA脱氨酶单体组成[19]，前者的同质二聚体是自然界本就存在的tRNA编辑酶，因此该野生型单体可能携带tRNA编辑酶属性(Losey等，2006)，tRNA突变将引起肿瘤、自身免疫病等一系列恶性疾病[20～23]。该野生型单体主要起结构性作用，在碱基编辑过程中并不发挥生物活性，通过RNA序列分析发现，该单体的RNA绑定序列为CUACGAA[24]，因此，去除该野生型单体成为降低碱基编辑酶编辑非目标tRNA概率的研究方向，但是单纯去除该野生型单体引起ABE编辑效率大大降低。通过蛋白序列分析，科学家们尝试修改个别野生型单体或突变型单体的氨基酸序列[25,26]，这样确实减少了非目标tRNA编辑，但目标位点DNA编辑效率也有不同程度的降低(Losey等，2006)， 因此这类ABE亚型应谨慎用于要求非目标tRNA编辑效率很低的情况。

也有报道将BE系统作为核糖蛋白微粒导入动物体内，其编辑效率低于将BE包装进质粒系统后再导入[27]，这可能是前者直接将可翻译成BE酶的mRNA暴露于宿主细胞，进而启动了宿主细胞清除异体mRNA的程序。因此有人尝试将此mRNA中的尿嘧啶进行5端甲基修饰，修饰后的BE-mRNA可不引起宿主细胞的免疫反应，从而达到令人满意的编辑效果[28]。

蛋白修饰虽然效果更直接，但是其操作需要较扎实的生物化学知识基础，化学修饰方法多样(甲基化、蛋白融合、氨基酸替换等)，没有统一的方法可以遵循，其最终产物是否符合预期，仍需要后续实验验证。但是在PACE无法产生目标产物时，化学修饰不失为一个可行的备选。

1.3将BE与其他物种的Cas9融合 BE系统识别PAM特异性主要依赖于nCas9基团，不同于传统的源于化脓性链球菌的Cas9，葡萄球菌来源的Cas9识别的PAM序列为NNGRRT。因此在目标序列周围没有NGG-PAM而存在其他菌属Cas9可识别的PAM时，将BE酶与该菌属Cas9融合不失为一种高效的策略。但这种载体的携带能力有限：腺相关病毒携带能力约为4.5 kb；化脓性链球菌Cas9大小约为4.2 kb，这几乎已占满载体的可用空间；葡萄球菌Cas9仅有3 kb大小，剩余充分的可用空间有利于后续蛋白修饰进一步提高蛋白活性，融合葡萄球菌Cas9的BE编辑效率与传统BE相当[29～31]。据此原理，嗜热链球菌Cas9、肠弯曲杆菌Cas9、脑膜炎奈瑟菌Cas9也相继问世，从而拓宽了基因编辑的应用范围[32～34]。

准确来说，该方法属于蛋白修饰的一个分支。但是其操作流程相对固定，且理论体系也较简单。但是目前市面上并无除化脓性链球菌Cas9-BE以外的其他菌属来源的BE。其后续是否会大规模生产取决于进一步实验能否验证这些菌属来源的BE具有相同可靠的碱基编辑效力。

2 碱基编辑在耳蜗中的初期应用

基因突变是引起先天性感音神经性聋的主要病因之一。由于掌管听觉神经传导的感觉细胞被包裹于颞骨的骨迷路中，因此耳蜗局部注射的基因编辑制剂能局限于骨迷路中。既往有大量报道应用耳蜗注射调节神经营养因子或者凋亡因子表达水平的基因制剂的研究，但这些制剂并不针对原发的基因突变。而对于针对突变基因的Crispr/Cas9基因修饰，由于其后续依赖的同源基因修复需要宿主细胞处于有丝分裂间期，而毛细胞或螺旋神经元均为永久细胞，不再发生有丝分裂，因此该方法在纠正耳蜗基因突变方面相当低效[5]。而且由于常染色体隐性遗传占耳聋相关基因疾病的多数(75%～80%)，单纯切除突变基因而没有正常等位基因代偿并不能有效纠正耳聋表型[35]。因此碱基编辑可能是目前攻克耳蜗基因突变疾病的武器，它能像Crispr/Cas9系统一样精准锚定目标序列，同时在不引起双链断裂前提下使突变碱基复原。近期已经有早期基础研究尝试将碱基编辑应用于耳蜗相关实验中。科学家们尝试应用CBE在耳蜗特异表达vGlut3、Otoferlin和Prestin蛋白的外显子中导入转录终止密码子，从而阻断毛细胞特异蛋白表达，并最终分别成功构建耳蜗毛细胞退化模型[36]。 另一项研究应用碱基编辑技术在Wnt通路相关蛋白序列中导入S33F突变、从而引起Wnt通路上调，进而成功诱导支持细胞向毛细胞异生[37]。耳蜗碱基编辑的初期研究结果令人满意，未来基于临床耳聋治疗的相关研究将进一步揭示碱基编辑的治疗潜力。

3 展望

随着新型碱基编辑酶变体不断被研发，在针对不同特定情况时，碱基编辑酶的选择也越来越多。针对不同情况的碱基编辑酶变体的不断增加，制定一套统一的碱基编辑酶使用指南越来越有必要，依此简化并进一步推广碱基编辑的临床应用。

在耳蜗中的应用方面，尽管目前没有明确证据证明碱基编辑能有效治愈先天性感音神经性聋，但是理论上来讲，碱基编辑能有效治疗耳聋基因病，主要理论依据有：①耳聋基因病中主要的突变类型为常染色体隐性遗传，等位基因上均为突变型，不存在正常模板序列，因此不需要依赖野生型模板，直接对该突变位点进行编辑；②碱基编辑酶在不引起DNA双链断裂的基础上对目标碱基进行编辑，从而最大程度上减少了对本来正常序列DNA的破坏，避免副产物的产生；③碱基编辑不依赖于DNA修复能力，后者在诸如毛细胞等高分化细胞中活性很低。同时，耳蜗局部注射基因制剂能有效降低基因制剂作用于其他器官从而产生副作用的可能性。在目前有限的耳蜗碱基编辑技术应用中，核糖核蛋白作为转运载体的优先度高于腺相关病毒，因为前者可有效避免不必要的外源DNA杂交进入宿主基因组[37,38]，而且此方法可明显降低非目标碱基编辑效率[38]。因此，近期针对提高碱基编辑系统精确性及生物活性的研究可能让碱基编辑技术为耳蜗病变的治疗带来良好的效果。