青枯菌噬菌体RPZH6株系对烟草青枯病的生防效果及全基因组测序分析

林志坚，陈长江，周挺，顾钢*，胡方平，李春英，蔡学清*

（1.福建农林大学植物保护学院，福州 350002；2.福建农林大学计算机与信息学院，福州 350002；3.福建省烟草公司烟草科学研究所，福州 350003）

青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）引起的作物青枯病是典型的维管束病害，该病菌可侵染番茄、辣椒和烟草等50多个科450余种作物，在我国长江流域及其以南地区普遍发生且有向北扩散的趋势，个别年份爆发流行，严重时甚至绝产[1-2]。自然状态下，青枯菌致病性、生理生化分化严重，寄主适应性强，属于土壤习居菌，给防治增加了难度[3]，目前主要采用抗病品种、栽培管理、轮作换茬、化学防治等措施进行防治。

噬菌体（bacteriophage）是一类专化性极强的细菌病毒，广泛存在于自然界中[4]，按生活周期可分为烈性噬菌体和温和性噬菌体。烈性噬菌体感染宿主菌后会裂解宿主菌释放子代，是细菌的天然杀手，能有效地控制宿主菌的种群数量[5]。噬菌体具有防控作物细菌性病害的巨大潜力，已应用于马铃薯黑胫病、玉米细菌性枯腐病、棉花黑枝病、梨火疫病等病害的防治[6]。Addy 等[7]从土壤中分离到一株肌尾噬菌体RsoM1USA，能显著抑制宿主菌的生长，但对番茄青枯病无防效；Wang 等[8]从生姜地中分离到一株能裂解青枯菌（演化型Ⅳ型）的烈性短尾噬菌体GP4，并进行了基因组测序分析；Van Truong 等[9]对长尾青枯菌噬菌体RS138 的基因组分析结果显示，其基因组全长41 941 bp，GC 含量65.1%，含56 个开放阅读框，不含tRNA；Ahmad 等[10]从青枯菌中分离到一株原噬菌体Rs551，噬菌体呈线状，长1 200 nm，宽7 nm，基因组全长7 929 bp，GC 含量61%，编码14 个开放阅读框，该噬菌体对其青枯菌的生长无影响，但能降低青枯菌的致病性从而推迟植株发病。近年来，尽管有很多青枯菌噬菌体被挖掘，但由于青枯菌的高度遗传多样性及噬菌体高度特异性，使得噬菌体对来源不同、类型不同的青枯菌表现出不同的侵染力[11-12]。因此，不同区域的青枯菌噬菌体在应用上有一定的局限性。为获得适合防治福建烟草青枯病的噬菌体，本课题组以福建烟草青枯病菌（Ralstonia solanacearum）为对象，从烟草根际土壤中分离获得一株烈性青枯菌噬菌体RPZH6，该噬菌体裂解谱广且对环境适应性强。为明确该噬菌体的生防潜力及分类地位，本研究测定了其生防效果并分析其全基因组序列，以期为该噬菌体的开发应用及其生防机制探讨提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

烟草青枯菌TBRS12 分离自福建省南平市政和县烟草病株，噬菌体RPZH6 分离自福建省南平市政和县烟草根际土壤，二者均由本实验室分离鉴定保存。烟草翠碧1 号种子由福建省烟草科学研究所提供。

TTC 固体培养基和NB 培养基[13]用于青枯菌及噬菌体培养。SM 缓冲液[14]用于噬菌体保存。DNase Ⅰ、RNase A、EcoRⅠ、蛋白酶K购自宝生物工程（大连）有限公司；57.6%氢氧化铜水分散粒剂，上海纽发姆化学品有限公司。氯化钠、聚乙二醇8000（PEG8000）、三氯甲烷、乙二胺四乙酸（EDTA）、Tris-酚、乙醇等均为国药分析纯。

1.2 方法

1.2.1 青枯菌的培养 将保存于-75 ℃的青枯菌在TTC 平板培养基上划线，28 ℃恒温培养24～48 h，挑取单菌落于NB 培养基中，28 ℃、180 r·min-1培养16～18 h，获得对数生长期（OD600值≈0.8）的菌液，用于噬菌体的培养和盆栽实验接种。

1.2.2 噬菌体的培养 取4 ℃保存的噬菌体RPZH6 菌液，按1%（体积分数）的量接种于培养好的青枯菌菌悬液中混匀，静置15 min，28 ℃、130 r·min-1振荡培 养12～16 h，培养液12 000 r·min-1离心5 min，取上清液，用0.45µm 滤膜抽真空过滤除菌，过滤液为噬菌体原液，效价为109pfu·mL-1，备用。

1.2.3 噬菌体对烟草青枯病的防效测定 将烟草种子点播到育苗盘中，每穴1 粒，待生长至3 片真叶时，移入AB∶150型花盆。置于温度25 ℃、光照16 h∕黑暗8 h的温室内培育至5片真叶，6株为1组，分别设计以下3 种处理：①每株浇灌30 mL 噬菌体RPZH6 原液；②每株浇灌30 mL 57.6%氢氧化铜水分散粒剂1 000倍液；③每株浇灌30 mL 无菌水；24 h 后，用灭菌的小刀在烟苗主根两侧各切1 刀，浇灌30 mL 烟草青枯菌菌TBRS12 悬液（OD6000.8）。以不浇灌TBRS12，只浇灌无菌水处理为空白对照（CK）。每个处理3 次重复，每重复6株。培养条件：白天30 ℃，夜间28 ℃，光照12 h、黑暗12 h 的温室里培养，每隔7 d 调查1 次病情[15]，计算病情指数和防效。

1.2.4 噬菌体核酸的提取及类型鉴定 参照《分子克隆实验指南》[16]方法获得粗制噬菌体颗粒，4 ℃保存备用。参考苏靖芳等[17]的方法提取噬菌体核酸，-25 ℃保存备用。核酸类型鉴定参考Jin 等[18]方法，在噬菌体核酸中分别加入DNase Ⅰ（RNase Free）、RNase A（DNase Free）和限制性内切酶EcoRⅠ，37 ℃温浴4 h 后，经1%（体积分数）琼脂糖凝胶电泳后于凝胶成像仪观察并拍照。

1.2.5 噬菌体全基因组测序 全基因组测序委托上海欧易生物医学科技有限公司完成。将检测合格的DNA 样品先经Covaris 随机打断成350 bp 的片段，采用TruSeq DNA LT Sample Prep kit 试剂盒进行建库，采用IlluminaHiSeq2000 进行测序。采用Trimmomatic软件进行包括去接头、低质量区域等质量过滤，其中平均每个碱基质量大于20，可用碱基错误概率小于0.001[19]。基因序列组装和拼接用MITObim(https:∕∕github.com∕chrishah∕MITObim)软件[20]。

1.2.6 噬菌体全基因组分析 使用BioEdit 软件[21]分析序列碱基成分；使用在线软件GeneMarks（http:∕∕exon.biology.gatech.edu∕GeneMark∕genemarks.cgi）对编码基因进行预测[22]；全基因图谱用在线软件CGView Server V 1.0（http:∕∕stothard.afns.ualberta.ca∕cgview_server∕）绘制[23]；获得的基因编码序列与GO（http:∕∕geneontology.org∕）、KEGG（https:∕∕www.kegg.jp∕）、COG（https:∕∕www.ncbi.nlm.nih.gov∕COG∕）和NCBI（https:∕∕www.ncbi.nlm.nih.gov∕）数据库比对进行基因功能注释（E-values＜1e-5）；使用在 线tRNAscan-SE(v1.3.1)（http:∕∕lowelab.ucsc.edu∕tRNAscan-SE∕）预测tRNA 编码序列[24]，其中参数Sequence source 选择bacterial，其他参数默认；用在线软 件Promoter Prediction（http:∕∕www.fruitfly.org∕seq_tools∕promoter.html）和 ARNold: finding terminators（http:∕∕rssf.i2bc.paris-saclay.fr∕toolbox∕arnold∕index.php）预测噬菌体的启动子序列和终止子序列[25-26]。通过NCBI 数据库比对和搜索，下载已公布的噬菌体全基因组序列和相关蛋白序列，比较基因组用在线软件Blastn（https:∕∕blast.ncbi.nlm.nih.gov∕Blast.cgi），比对结果 用Esayfis 2.2.2 软件进行可视化[27]；序列多重比对用MAFFT 7.427软件，用PhyloSuite V1.2.1 软件中 的ModelFinder 模块计算最佳模型，用IQ-TREE 模块构建系统发育树，Bootstrap抽样1 000次[28-30]。

1.2.7 数据分析 试验数据采用Excel、DPS 15.10 软件进行处理和统计分析，采用Duncan 氏新复极差法进行差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 噬菌体RPZH6对烟草青枯病的防治效果

噬菌体RPZH6 对烟草青枯病的生防效果（表1）显示，接种后14 d，噬菌体和氢氧化铜处理的病情指数显著低于对照组，噬菌体RPZH6 对烟草青枯病的防治效果为58.83%；接种后21 d，防效为60.98%；接种后35 d，噬菌体RPZH6 的防治效果仍有53.85%，显著高于氢氧化铜处理。

表1 噬菌体RPZH6对烟草青枯病的防治效果Table 1 Control effect of phage RPZH6 on tobacco bacterial wilt

2.2 噬菌体的核酸类型鉴定

分别用DNase Ⅰ、RNase A 及EcoRⅠ酶切噬菌体的核酸，电泳结果如图1，噬菌体RPZH6的核酸能被DNase Ⅰ消化，同时能被限制性内切酶EcoRⅠ切成多个条带，但不被RNase A 降解，说明噬菌体RPZH6的核酸类型为双链DNA（dsDNA）。

图1 噬菌体RPZH6核酸酶切Fig.1 Enzyme digestion of nuclear acid of phage RPZH6

2.3 噬菌体RPZH6的基因组特性分析

经测序，获得30.16 Mb 原始测序数据reads数，4.52 Gb 原始测序数据量，质控处理后，有效reads数为25.41 Mb，有效数据量为3.81 Gb。经过拼接、组装，噬菌体RPZH6 的基因全长64 657 bp（GenBank 登录号：MT361768），GC 含量64.84%，其中A、C、G、T 含量分别为15.88%、33.15%、31.70%、19.28%。噬菌体RPZH6 预测含有92 个开放阅读框（open reading frame，ORF），1 个tRNA基因（tRNA-Ser-TAG）（图2），30 个启动子序列和18 个终止子序列。预测的开放阅读框序列总长58 694 bp，平均长度638 bp，占全基因组总长90.78%；起始密码子为ATG 的有74 个，GTG 的有12 个，TTG 的有5 个，TAT 的1 个。在92 个开放阅读框中，只有16 个正向排列，占17.4%；其他均为反向排列。

图2 噬菌体RPZH6全基因图谱Fig.2 Complete gene map of phage RPZH6

2.4 基因功能分析

对预测得到的编码基因在GO、KEGG、COG NR 等数据库进行功能注释。结果显示，噬菌体RPZH6 的92 个ORFs 中，有47 个被注释为功能蛋白（表2），42 个被注释为假定蛋白，3 个在数据库中比对不到任何信息。在47 个功能蛋白中，噬菌体结构蛋白有4 个，分别为衣壳蛋白（ORF5）、门脉蛋白（ORF11）、尾纤蛋白（ORF80～81）；噬菌体相关功能蛋白有26 个，主要包括病毒粒子相关蛋白（ORF4、74、76、79、82、84、85、88）、复制蛋白（ORF42）、DNA 结合蛋白（ORF50、57、58）、类RecT 蛋白（ORF56）、DarB 类抗抑制蛋白（ORF72、73、90）等；噬菌体相关酶蛋白有10 个，包括末端酶（ORF14、32）、裂解酶（ORF16）、HNH 归巢核酸内切酶（ORF34）、Recb 内切酶（ORF55）、DNA 聚合酶（ORF59）、酪氨酸重组酶（ORF63、64）等；噬菌体转录调节因子有6 个，分别为1 个碳储调节因子（ORF7）和5 个转录调控因子（ORF1、24、52～54）。

表2 噬菌体RPZH6基因组47个ORF功能预测Table 2 ORF function prediction of the phage RPZH6 genome

表2 噬菌体RPZH6基因组47个ORF功能预测Table 2 ORF function prediction of the phage RPZH6 genome 续表Continued

2.5 比较基因组及系统发育分析

在NCBI 数据库上BLASTn 比对显示，噬菌体RPZH6 的全基因组与Ralstoniaphage GP4（MH638294，覆盖率76%，一致性95.00%）、Burkholderiavirus Bcep22（AY349011，覆盖率16%，一致性 80.57%）、Burkholderiavirus BcepMigl（JX104231，覆盖率15%，一致性80.21%）、Burkholderiavirus BcepIL02（FJ937737，覆盖率13%，一致性80.79%）和Burkholderiavirus DC1（JN662425，覆盖率13%，一致性81.22%）相似。与其中2 株相似度最高的噬菌体全基因组比较分析结果如图3，噬菌体RPZH6 与GP4 表现相似的基因排列结构，但在部分区域序列（如ORF34～ORF46 之间）存在一些差异；与Bcep22 基因排列结构差异较大，相同功能的基因在基因组中的分布位置不同。

图3 菌体RPZH6与GP4、Bcep22全基因组序列比对Fig.3 Complete genome alignment of phage RPZH6 with GP4 and Bcep22

为进一步明确噬菌体RPZH6的分类地位。基于保守的衣壳蛋白基因（ORF5）和尾纤蛋白基因（ORF80）的氨基酸序列，分别以LG+F+G4（ORF5）和PMB+F+G4（ORF80）为最佳建树模型，采用最大似然法（maximum likelihood，ML）分别构建系统发育树。结果显示，基于衣壳蛋白氨基酸序列构建的系统发育树（图4A），噬菌体RPZH6 与Ralstoniaphage GP4聚成一支，与噬菌体Bcep22、BcepIL02、BcepMigl和DC1聚为同一亚枝；基于尾纤蛋白氨基酸序列构建的系统发育树（图4B），噬菌体RPZH6与Burkholderiavirus DC1 聚为一支，而噬菌体Ralstoniaphage GP4、Burkholderiavirus DC1、Bcep22、BcepIL02 及BcepMigl 均属于短尾噬菌体科、Bcep22属，表明噬菌体RPZH6也属于短尾噬菌体科、Bcep22家族。

图4 基于衣壳蛋白序列和尾纤蛋白序列构建的系统发育树Fig.4 Phylogenetics tree were based on major capsid protein and tail fiber protein

3 讨论

作物青枯病是一种世界分布的细菌性病害，化学防治是控制该类病害的主要手段之一，但防治该类病害的农药种类较少，防效不理想。利用噬菌体防治细菌性病害已有很长的历史，自发现噬菌体以来，人们就尝试应用噬菌体防治植物细菌性病害。由于细菌对抗生素产生抗性并渐增，利用噬菌体防治细菌性病害的技术越来越受重视[6,31]。高苗等[14]从烟草病圃土壤中分离到一株肌尾噬菌体∈RS-1，并研究了其生物学特性；Tanaka等[32]利用噬菌体防治烟草青枯病取得良好的效果；Wei 等[33]研究不同噬菌体混合制剂防治马铃薯青枯病，经噬菌体处理的植株，青枯病发病率降低20%；苏靖芳等[17]从土壤中分离获得1 株短尾噬菌体RS-PII-1，并对其基因组学进行分析。本研究从烟草根际土壤中分离获得一株能在宿主菌苔上产生透明、圆形的噬菌斑，并能使宿主菌液变澄清的烈性青枯菌噬菌体RPZH6，盆栽防效测定结果显示，接种后21 d，对烟草青枯病的防治效果为60.98%；接种后35 d，防效仍有53.85%，其防效显著高于化学药剂。

核酸类型是噬菌体重要的分类依据，根据核酸类型，噬菌体可分为dsDNA 病毒、ssDNA 病毒、dsRNA 病毒和ssRNA 病毒[34]。目前已报道的青枯菌噬菌体主要有2 种：一种为dsDNA 病毒，如长尾噬菌体（Siphoviridae）ΦRS138[9]、短尾噬菌体（Podoviridae）RS-PII-1[17]和phiAP1[35]、肌尾噬菌体（Myoviridae）ΦRSF1 和ΦRSL2[36]等；另一种 为ssDNA 病毒，如丝状噬菌体（Inoviridae）ΦRs551[10]等。本研究获得的噬菌体RPZH6 核酸类型为dsDNA，基因组全长64 657 bp，GC 含量64.84%，含有92 个ORFs，1 个tRNA-Ser-TGA。与其他青枯菌噬菌体相比，噬菌体RPZH6 的GC 含量高于多个已报道的噬菌体，如RS-PII-1 为63.2%[17]、phiAP1为61%[35]；Ralstoniaphage GP4为64.01%等[8]。同时，噬菌体RPZH6 的全基因组长度也大于同类噬菌体，RS-PII-1 长42 042 bp，phiAP1 长44 793 bp，Ralstoniaphage GP4 长61 129 bp。另外，在预测的ORF 框中，噬菌体RPZH6 存在3 个未知蛋白，在数据库中比对不到相近的蛋白产物，说明噬菌体在进化过程中存在遗传多样性。基于衣壳蛋白、尾纤蛋白的氨基酸序列构建的系统发育树分析显示，噬菌体RPZH6 与Bcep22-like 家族的短尾噬菌 体 phage GP4、phage Bcep22、phage BcepIL02、phage BcepMigl 和phage DC1 聚成一支。Blastn 比对分析显示，噬菌体RPZH6 与Ralstoniaphage GP4 有较高的同源性，但覆盖率仅为76%，覆盖区的一致性为95%。基于全基因组序列比较分析，噬菌体RPZH6 与Ralstoniaphage GP4 的基因排列结构相似性较高，但在ORF34～ORF46 等区域之间存在一些差异，序列同源性低（图3）。寄主范围上，Ralstoniaphage GP4 主要寄生姜青枯病菌及部分桑青枯病菌[8]，而噬菌体RPZH6 的宿主菌为烟草、番茄、辣椒和甘薯青枯病菌(实验室数据)。综上分析，认为噬菌体RPZH6 属于Bcep22 家族成员，是一株新的青枯菌短尾噬菌体。