FGFR3和EXT基因突变与髁突骨软骨瘤相关性研究

张 哲，王卫红,，杨 春，刘 屿，钱叶梅，李静宜

骨软骨瘤(osteochondroma)又叫骨软骨外生骨疣，分为单发性和多发性两种。发生于颌面部者较少，以下颌骨髁突常见。髁突骨软骨瘤在临床上表现为面部不对称、颞下颌关节功能障碍、错牙合、张口障碍等。85%骨软骨瘤是孤立的(非遗传性)病变，15%为遗传性多发性骨软骨瘤(hereditary multiple exostoses，HME)，HME是一种比较少见的常染色体显性遗传性骨骼异常疾病。70%～94% HME患者存在EXT1和EXT2基因突变，此外在孤立性骨软骨瘤中也发现EXT1和EXT2基因纯合缺失[1]。另外，FGFR3是软骨内骨化过程中的主要成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor，FGF)受体(FGFR)，主要在肥大前的软骨细胞中表达，抑制软骨细胞的增殖和分化，而FGFR3突变时可增强软骨细胞的信号，促进软骨细胞增殖[2-3]。以上研究提示EXT和FGFR3基因可能是髁突骨软骨瘤疾病的关键因素。本研究探讨髁突骨软骨瘤与EXT1和FGFR3基因突变之间的关系，为临床诊治髁突骨软骨瘤提供理论基础。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2017年1月—2021年6月在昆明医科大学附属口腔医院口腔颌面外科诊断为髁突骨软骨瘤的住院患者，进行术前CBCT检测和99mTc核素扫描，排除全身其他骨代谢异常，使用SimPlant Pro11.04软件重建颌骨影像，分析其临床表现及影像特征等。经与患者及家属沟通协商，3例患者接受基因检测，采集患者2～4 mL外周血置于EDTA抗凝管中，委托北京赛福基因公司进行基因全外显子检测。本研究经昆明医科大学附属口腔医院伦理委员会的批准(伦理号：KYKO2021MEC031)。

1.2 免疫组化染色

手术切除后的髁突骨软骨瘤标本经脱钙后，石蜡包埋，HE染色。另取3 μm切片脱蜡水化，一抗EXT1(1∶200)(Affinity公司)、FGFR3(1∶200)(Affinity公司)和雌激素受体抗体(雅吉生物技术有限公司)4 ℃过夜，二抗室温孵育，DAB显色，苏木素复染，封片。根据Torlakovic[4]的方法，在每个切片中软骨帽区域的视野中对EXT1和FGFR3阳性细胞的平均数量进行分别计数(放大400倍)，EXT1和FGFR3染色阳性细胞达10%和10%以上被判断为阳性，阳性细胞少于10%的未染色或散在的染色区域被判断为阴性。

2 结 果

2.1 临床特征

共10例孤立性髁突骨软骨瘤。男4例，女6例，男女比例为1∶1.5，年龄11～55岁，平均37.1岁。左右侧之比为9∶1。病史平均1.82年。9例患者存在面部不对称，6例患者开口受限，5例开口偏斜，3例关节区疼痛，1例关节弹响。CBCT表现为髁突不规则骨性隆起，骨皮质轮廓与肿瘤相连续(图1)。99mTc核素扫描显示全身骨骼显像清楚，患侧髁突较对侧出现放射性异常浓聚，骨代谢活跃(图2)。10例患者经耳前入路或下颌后入路，行髁突部分切除术或髁突全切除术彻底切除髁突骨软骨瘤(图3)。病理结果显示10例均为髁突骨软骨瘤。10例髁突骨软骨瘤病例术后随访2个月～4年，未见骨软骨瘤复发。

A：髁状突软骨瘤CBCT影像示髁突不规则增大；B：99mTc核素扫描显示右侧髁突区域放射性核素浓聚

图2 全身诸骨显影清，右侧颞颌关节区放射性较浓聚，其余骨骼放射性分布均匀

A：髁状突软骨瘤CBCT影像示左侧髁突不规则肿瘤；B：患者存在面部不对称，颞下颌关节区域肿胀及错牙合等症状；C：手术经左侧下颌后入路切口；D：完整切除的髁突骨软骨瘤及髁突；E：下颌升支矢状劈开截骨术恢复髁突高度；F：术后患者面部外形及咬合基本恢复正常

2.2 基因突变

对10例病例中的3例患者行全外显子检测，病例1，男，45岁，面部畸形两年伴咬合紊乱。病例2，女，19岁，自觉面部不对称影响美观，开口歪斜。病例3，女，30岁，面部畸形1年余。均存在FGFR3基因突变，其中2例存在共同位点突变(图4)，Chr4：1801717.NM_000142.4：exon6：c.713G>A，导致第238位精氨酸变为谷氨酰胺(p.Arg238Gln)。2例患者存在EXT1基因突变(图5)，且位于同一位点，Chr8：117807339.NM_000127.2：exon9：c.1761G>A。为同义突变(p.Glu587=)。

图4 一代测序显示FGFR3基因杂合突变

图5 一代测序显示EXT1基因杂合突变

2.3 HE染色和免疫组织化学染色

HE染色镜下见由外向内为表面致密的纤维组织包膜、靠近基底逐渐成熟的软骨细胞及骨质交界的骨化现象和新骨形成(图6)。免疫组化显示8例髁突骨软骨瘤中EXT1蛋白均阳性，表达于软骨细胞胞质(图7)。1例患者EXT1和FGFR3蛋白均为阳性表达(图8)。10例患者雌激素受体均为阴性(图9)。

A：骨软骨瘤全貌( ×40)；B：由外到内可见纤维层(黑色箭头)、未分化间充质层(红色箭头)、增生前和增生的软骨组织(蓝色箭头)及散在的软骨岛(黄色箭头)( ×400)

图7 免疫组化显示EXT1强阳性表达，EXT1主要在软骨层中表达，位于未分化的间充质层和增生前和增生软骨层中，主要位于增生前细胞中( ×400)

图8 免疫组化结果弱阳性，在软骨未分化间充质层，增生前和增生的软骨组织中，10%细胞质中FGFR3呈弱阳性表达( ×400)

图9 免疫组化髁突骨软骨瘤中雌激素受体呈阴性( ×400)

3 讨 论

骨软骨瘤(osteochondroma)发生于颌骨者较少，诊断通常要结合临床和影像学的表现。但从组织学上无法区分孤立性和多发性骨软骨瘤，可通过全身99mTc核素扫描， 排除全身骨组织其他代谢异常。

发生于髁突的骨软骨瘤可致患者面部不对称、颞下颌关节区域肿胀、张口障碍、颞下颌关节功能障碍和错牙合。髁突骨软骨瘤CT表现为髁突骨性隆起，骨皮质轮廓与肿瘤之间相连续；外形不规则[5]；99mTc核素扫描表现局部核素浓聚[6]。组织学上表现为软骨细胞成簇排列，存在异常的软骨增生和钙化。对于髁突骨软骨瘤的治疗包括病损切除、畸形的颌骨正颌矫正以及自体或异体颞下颌关节重建[7-8]。对于病损的切除包括髁突部分切除术和髁突全切除术，如果肿瘤累及髁突头部但不累及髁突颈部，则应采取部分切除术式[9]。髁突骨软骨瘤通常无自限性，术后可能复发，有趣的是Roychoudhury在对文献报道的98例病例进行仔细研究后认为手术方法的选择与复发率无关[10]。髁突骨软骨瘤发生于成年女性较多。Roychoudhury等[10]回顾108例髁突骨软骨瘤患者，男女比为1∶1.6，平均38.4岁。Peroz等[11]回顾235例颌面骨软骨瘤病例，男女比为1∶1.85，平均41岁。本研究结果显示男女比例为1∶1.5，平均年龄为37.1岁，这与上述文献报道的基本一致。女性发病率可能与雌激素参与病程演变有关，并有动物研究表明雌性灵长类动物的颞下颌关节中存在雌激素受体。然而，本免疫组化研究结果显示雌激素受体表达均为阴性。因此，骨软骨瘤与雌激素在蛋白表达层面并无明显相关性。

骨软骨瘤在HE染色显示形态上类似于正常的软骨内骨化现象，但是骨软骨瘤仍被定义为真正的肿瘤。因其软骨帽中发现了细胞遗传学异常，非整倍性和杂合性丧失(LOH)，这与EXT基因的位置有关。临床研究表明EXT参与非遗传性骨软骨瘤的发展，孤立性髁突骨软骨瘤与EXT基因有关[12-15]。EXT1基因碱基对数目约为312 kb，含11个外显子，编码含746个氨基酸的蛋白质。EXT2基因碱基对数目约为149 kb，含14个外显子，编码含718个氨基酸的蛋白质。EXT突变导致其编码的糖基转移酶(exostosin)合成的缺失或不足，从而干扰硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(heparan sulfate proteoglycan，HSPG)合成，HSPG与生长因子结合并参与软骨细胞的信号转导过程[16-18]。有趣的是Toydemir等[19]报道由FGFR3突变引起的CATSHL综合征的家庭中，有几个成员的长骨中发现骨软骨瘤。类似地，Talbot等[20]报道1例由FGFR3突变引起的Muenke综合征患者，该患者四肢多个骨软骨瘤。FGFR3是软骨内骨化过程中的主要FGFR，主要在肥大前的软骨细胞中表达，并抑制软骨细胞的增殖和分化，而FGFR3突变时可增强IHH信号，促进软骨细胞增殖[2]。Zhou等[3]研究表明FGFR3功能丧失导致MEK/ERK信号下调和IHH上调导致软骨样病变形成，而IHH信号抑制剂治疗可减少FGFR3缺陷小鼠软骨瘤样病变的发生。在本研究中，共8例髁突骨软骨瘤组织行免疫组化染色，EXT1蛋白均阳性表达于软骨细胞胞质，1例EXT1和FGFR3蛋白均为阳性表达。有3例髁突软骨瘤患者行基因检测，FGFR3基因均发生突变。其中2例存在共同位点突变。EXT突变间接导致HSPG合成不足。而HSPG广泛存在于细胞膜和细胞外基质中，与FGF和骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)结合，并参与软骨细胞的信号转导过程，调节软骨细胞生长、分化的和成熟[21-24]。因此，髁突骨软骨瘤不仅与EXT1基因突变有关，与FGFR3基因突变也存在相关性。其具体相关机制还需要进一步研究证实[25]。

利益冲突声明：无。