LncRNA MALAT1调节miR-383-5p/SOCS3轴对人牙周膜干细胞的影响

顾婷立，刘亚华，钱 靓，章 茜

牙周炎是一种牙周支持组织的慢性感染性疾病[1]。在炎症条件下，人牙周膜干细胞(human periodontal ligament stem cells，hPDLSCs)成骨分化能力降低，无法实现有效的牙周支持组织再生[2]。长链非编码RNA(long non-coding RNA，LncRNA)参与多种生物过程[3]，肺腺癌转移相关转录本1(metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1)是一种与牙周炎进展有关的LncRNA。研究显示MALAT1在牙周炎患者的hPDLSCs中明显高表达[4]，可促进人牙龈成纤维细胞中炎性因子的分泌[5]，但MALAT1在牙周炎中的分子机制尚不清楚。既往研究表明，微小RNA(microRNA，miRNA)可以通过干扰牙周细胞的分化、再生和修复来调节牙齿发育网络[6-7]。微小RNA-383-5p(miRNA-383-5p，miR-383-5p)可参与调节hPDLSCs的成骨分化[8]。此外，细胞因子信号转导负调控因子3(suppressor of cytokine signaling 3，SOCS3)在多种细胞生物学过程中发挥重要作用，已被证实与糖尿病小鼠的牙周炎症有关[9-10]。本研究首次探讨了MALAT1/miR-383-5p/SOCS3轴在hPDLSCs增殖、凋亡以及成骨分化中的作用及LncRNA-miRNA-mRNA调控网络，为牙周修复提供新的治疗靶点。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

hPDLSCs(PC-025h)(赛奥斯，中国武汉)，牙龈卟啉单胞菌脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)(SMB00610)(Sigma，美国)，青霉素-链霉素-谷氨酰胺(10378016)、胎牛血清(1009914C)和DEME培养基(11965118)(Gibco，美国)，PrimeScript cDNA合成试剂盒(D6110A)、Green Premix Ex Taq(RR420A)(TAKARA，日本)，一抗SOCS3(ab280884)、GAPDH(ab8245)、PCNA(ab29)、Ki-67(ab92742)、Bcl-2(ab32124)、Bax(ab32503)、OSX(ab209484)和OCN(ab133612)(Abcam，英国)，Immun-StarTMHRP化学发光试剂盒(1705040)(Bio-Rad，美国)，CCK-8试剂盒(CA1210)(Solarbio，中国)，TUNEL凋亡试剂盒(AT2190)、BCIP/NBT显色试剂盒(APR1100)、茜素红S(alizarin red S，ARS)染色液(A39470)(吉至，中国上海)，成骨诱导试剂盒(FY200006)(弗元生物，中国上海)，碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性测定试剂盒(mlE3570)(酶联生物，中国上海)，TNF-α ELISA试剂盒(EK0525)、IL-6 ELISA试剂盒(EK0410)和IL-1β ELISA试剂盒(EK0392)(博士德，中国武汉)，双荧光素酶检测试剂盒(LF001)(Gene Copoeia，美国)。

SpectraMax iD3型多功能酶标仪(Molecular Devices，美国)，7500实时荧光定量PCR仪器(ABI，美国)，OmegaLum C 化学发光凝胶成像系统(aplegen，美国)、DMi8荧光显微镜(Leica，德国)。

1.2 细胞分组与转染

取第3～5代hPDLSCs用于实验，将细胞按以下分组处理。Control组：不做处理；LPS组：仅用LPS处理；LPS+si-NC组：转染si-NC后LPS处理；LPS+si-MALAT1组：转染靶向MALAT1的小干扰RNA(si-MALAT1)后LPS处理；LPS+si-MALAT1+in-miR-383-5p组：转染si-MALAT1和miR-383-5p抑制物(in-miR-383-5p)后LPS处理；LPS+si-MALAT1+SOCS3组：转染si-MALAT1和SOCS3过表达质粒(SOCS3)后LPS处理。LPS终浓度1 mg/L[11]，所有细胞处理48 h后用于后续实验。

1.3 ELISA实验

收集各组hPDLSCs细胞上清液，按照试剂盒说明书检测TNF-α、IL-6和IL-1β水平。酶标仪测定各孔450 nm处OD值，根据标准曲线获得相应的细胞因子水平。

1.4 RT-qPCR实验

提取各组hPDLSCs总RNA，使用PrimeScript cDNA合成试剂盒制备cDNA。随后使用Green Premix Ex Taq试剂进行RT-qPCR，引物序列见表1。使用2-ΔΔct法归一化为GAPDH/U6表达。

表1 引物序列表

1.5 Western blot实验

使用RIPA裂解缓冲液提取各组hPDLSCs总蛋白，经定量后通过适当的SDS-PAGE分离蛋白(50 μg/泳道)并转移到PVDF膜上，然后使用5%脱脂牛奶在TBST缓冲液中封闭2 h。将膜与SOCS3、PCNA、Ki-67、Bcl-2、Bax、OSX、OCN和GAPDH一抗(1∶1 000)4 ℃过夜孵育。一抗孵育后使用HRP偶联的二抗(1∶1 000)在室温下培养45 min。经Immun-StarTMHRP化学发光试剂显影后于检测器上观察蛋白质条带。灰度值使用Image J量化。

1.6 CCK-8检测

将hPDLSCs细胞(1×104个/孔)接种在96孔板中，培养24 h后每孔加入10 μL的CCK-8试剂，4 h后再使用酶标仪测量450 nm处OD值。

1.7 TUNEL检测

将hPDLSCs细胞在室温下用4%多聚甲醛固定30 min后，使用0.2% Triton X-100透化8 min。加入TUNEL溶液在37 ℃下孵育60 min，PBS洗涤后再加入DAPI染色液对细胞核染色8 min。使用荧光显微镜观察6个视野中的凋亡细胞，凋亡指数=凋亡细胞数(绿色荧光)÷总细胞数(蓝色荧光)×100%。

1.8 ALP染色和活性分析

将转染的hPDLSCs细胞接种在6孔培养板中并在成骨诱导培养基中培养14 d后，①ALP活性分析：收集细胞后按照ALP活性测定试剂盒说明书操作，在微孔板分光光度计520 nm波长处检测细胞的OD值；②ALP染色：PBS洗涤细胞后使用4%多聚甲醛固定30 min，向每孔添加适量的BCIP/NBT溶液避光孵育后进行拍照。

1.9 ARS染色

将转染的hPDLSCs细胞接种在6孔培养板中并在成骨诱导培养基中培养21 d后，PBS洗涤后加入4%多聚甲醛固定30 min，加入ARS染色溶液染色30 min。使用倒置显微镜对矿化结节进行拍照，酶标仪于520 nm波长下检测OD值。

1.10 双荧光素酶报告基因检测

使用Starbase数据库确定MALAT1和miR-383-5p之间的结合位点，并预测miR-383-5p的潜在靶标SOCS3。构建含有预测miR-383-5p结合位点的野生型MALAT1/3′-UTR-SOCS3(WT-MALAT1/WT-3′-UTR-SOCS3)和突变型MALAT1/3′-UTR-SOCS3(MUT-MALAT1/MUT-3′-UTR-SOCS3)，并克隆到psiCHECK-2表达载体上，使用Lipofectamine 3000转染试剂将WT-MALAT1/3′-UTR-SOCS3或MUT-MALAT1/3′-UTR-SOCS3和miR-383-5p mimics或miR-NC共转染到hPDLSCs细胞中。48 h后根据试剂盒说明分析荧光素酶活性。

1.11 统计学分析

使用SPSS 22.0分析数据，并在本研究中以平均值±标准差表示。两组之间比较采用独立t检验，三组或三组以上的差异比较采用单因素方差分析和Turkey′s事后检验。P<0.05被认为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 hPDLSCs细胞中炎症因子表达情况

表2显示，与Control组比较，LPS组hPDLSCs细胞中TNF-α、IL-1β和IL-6水平明显升高(P<0.05)。与LPS+si-NC组比较，LPS+si-MALAT1组hPDLSCs细胞中TNF-α、IL-1β和IL-6水平明显降低(P<0.05)。与LPS+si-MALAT1组比较，LPS+si-MALAT1+in-miR-383-5p组和LPS+si-MALAT1+SOCS3组hPDLSCs细胞中TNF-α、IL-1β和IL-6水平均明显升高(P<0.05)。

表2 各组hPDLSCs细胞中TNF-α、IL-1β和IL-6水平

2.2 hPDLSCs细胞中MALAT1、miR-383-5p和SOCS3表达情况

与Control组比较，LPS组hPDLSCs细胞中MALAT1和SOCS3表达水平均升高，miR-383-5p表达水平降低(P<0.05)。与LPS+si-NC组比较，LPS+si-MALAT1组hPDLSCs细胞中MALAT1和SOCS3表达水平均降低，miR-383-5p表达水平升高(P<0.05)。与LPS+si-MALAT1组比较，LPS+si-MALAT1+in-miR-383-5p组hPDLSCs细胞中MALAT1表达水平变化无差异(P>0.05)，miR-383-5p表达水平降低，SOCS3表达水平升高(P<0.05)；LPS+si-MALAT1+SOCS3组hPDLSCs细胞中MALAT1和miR-383-5p表达水平变化无差异(P>0.05)，SOCS3表达水平升高(P<0.05)(图1、表3)。

a～f依次为Control组、LPS组、LPS+si-NC组、LPS+si-MALAT1组、LPS+si-MALAT1+in-miR-383-5p组和LPS+si-MALAT1+SOCS3组

表3 各组hPDLSCs细胞中MALAT1、miR-383-5p和SOCS3表达

2.3 hPDLSCs细胞增殖活力、凋亡情况

与Control组比较，LPS组hPDLSCs细胞活力降低，凋亡指数升高；细胞中PCNA、Ki-67、Bcl-2蛋白水平降低，Bax蛋白水平升高(P<0.05)。与LPS+si-NC组比较，LPS+si-MALAT1组hPDLSCs细胞活力升高，凋亡指数降低；细胞中PCNA、Ki-67、Bcl-2蛋白水平升高，Bax蛋白水平降低(P<0.05)。与LPS+si-MALAT1组比较，LPS+si-MALAT1+in-miR-383-5p组和LPS+si-MALAT1+SOCS3组hPDLSCs细胞活力降低，凋亡指数升高；细胞中PCNA、Ki-67、Bcl-2蛋白水平降低，Bax蛋白水平升高(P<0.05)(表4、图2～3)。

a～f依次为Control组、LPS组、LPS+si-NC组、LPS+si-MALAT1组、LPS+si-MALAT1+in-miR-383-5p组和LPS+si-MALAT1+SOCS3组

表4 各组hPDLSCs细胞活力、凋亡指数以及PCNA、Ki-67、Bcl-2和Bax蛋白水平统计

2.4 hPDLSCs细胞成骨分化情况

与Control组比较，LPS组hPDLSCs细胞中ALP染色和活性、ARS钙沉积物的浓度减少，细胞中OSX和OCN蛋白水平降低(P<0.05)。与LPS+si-NC组比较，LPS+si-MALAT1组hPDLSCs细胞中ALP染色和活性、ARS钙沉积物的浓度升高，细胞中OSX和OCN蛋白水平升高(P<0.05)。与LPS+si-MALAT1组比较，LPS+si-MALAT1+in-miR-383-5p组和LPS+si-MALAT1+SOCS3组hPDLSCs细胞中ALP染色和活性、ARS钙沉积物的浓度减少，细胞中OSX和OCN蛋白水平降低(P<0.05)(表5、图4～5)。

a～f依次为Control组、LPS组、LPS+si-NC组、LPS+si-MALAT1组、LPS+si-MALAT1+in-miR-383-5p组和LPS+si-MALAT1+SOCS3组

表5 各组hPDLSCs细胞中ALP活性、ARS染色和OSX、OCN蛋白水平统计

a～f依次为Control组、LPS组、LPS+si-NC组、LPS+si-MALAT1组、LPS+si-MALAT1+in-miR-383-5p组和LPS+si-MALAT1+SOCS3组

2.5 MALAT1、miR-383-5p和SOCS3在hPDLSCs细胞中的关系

miR-383-5p与MALAT1或SOCS3 3′-UTR存在靶向结合位点(图6)。双荧光素酶结果显示(表6)，转染miR-383-5p mimics能特异性降低WT-MALAT1或WT-3′-UTR-SOCS3的荧光素酶活性(P<0.05)，而不能特异性降低MUT-MALAT1或MUT-3′-UTR-SOCS3的荧光素酶活性(P>0.05)；同时转染miR-NC对WT-MALAT1或WT-3′-UTR-SOCS3与MUT-MALAT1或MUT-3′-UTR-SOCS3荧光素酶活性均无影响(P>0.05)。因此可得出，在hPDLSCs细胞中MALAT1与miR-383-5p之间存在相互作用关系，miR-383-5p与SOCS3之间存在相互作用关系。

表6 双荧光素酶报告基因测定miR-383-5p与MALAT1或SOCS3 3′-UTR靶向关系

图6 Starbase网站预测miR-383-5p与MALAT1或SOCS3 3′-UTR互补位点

3 讨 论

牙周炎是一种慢性疾病，药物治疗可作为机械清除菌斑牙石的辅助治疗[12]。hPDLSCs因具有高增殖、自我更新和多分化能力，在牙周炎组织修复中至关重要[2]。本研究通过LPS构建hPDLSCs细胞炎症模型发现，LPS刺激后hPDLSCs表达促炎因子(TNF-α、IL-1β和IL-6)水平升高，与Nie等[11]报道一致。LPS还可通过抑制软骨细胞增殖相关蛋白(PCNA、Ki-67)表达，同时上调促凋亡蛋白Bax，下调抗凋亡蛋白Bcl-2水平，进而抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡[13]，本研究结果与之相似。ALP活性和矿化程度是成骨分化的标志[14]。本研究中LPS刺激后hPDLSCs中ALP的活性和矿化程度均受到抑制，同时成骨分化标志物OCN和转录因子OSX的表达下降。以上数据表明，LPS刺激在诱导hPDLSCs炎症和凋亡损伤的同时也削弱了细胞增殖和成骨分化能力。

a～f依次为Control组、LPS组、LPS+si-NC组、LPS+si-MALAT1组、LPS+si-MALAT1+in-miR-383-5p组和LPS+si-MALAT1+SOCS3组

MALAT1高表达可促进帕金森病等疾病的发展[15]，下调MALAT1表达可能有利于治疗疾病。MALAT1通过上调成纤维细胞生长因子2促进hPDLSCs的增殖[4]。此外，MALAT1还可通过海绵化miR-20a和激活TLR4促进LPS刺激的人牙龈成纤维细胞中炎性细胞因子的产生[5]。MALAT1敲低后可通过miR-769-5p/HIF3A轴削弱LPS刺激下hPDLSCs表达促炎因子(TNF-α、IL-1β和IL-6)的水平，进而抑制炎症反应[16]。本研究结果发现，LPS刺激可明显上调hPDLSCs中MALAT1的表达，进一步结果表明敲低MALAT1不仅抑制了LPS刺激的hPDLSCs促炎因子(TNF-α、IL-1β和IL-6)的分泌，同时增强了细胞活力并抑制了细胞凋亡。此外，MALAT1敲低部分恢复了LPS刺激下hPDLSCs下调的成骨分化能力。以上这些结果表明敲低MALAT1可能抑制牙周炎的发生和发展。

LncRNA通过海绵化miRNA并调控靶基因的表达，进而参与调控多个生物过程，如LncRNA HOTAIRM1海绵化miR-433-5p促进PIK3CD表达，进而加速多囊卵巢综合征的发展[17]。越来越多的研究表明，MALAT1可以作为一种内源竞争RNA来调节miRNA的表达和靶基因的活性[16]。通过使用生物信息学对MALAT1预测靶点进行分析，确定了很多潜在的靶点包括miR-383-5p、miR-4524b-5p、miR-503-5p等，这些靶点多与人类癌症的发展相关。其中，miR-383-5p可通过抑制HDAC9表达促进hPDLSCs的成骨分化[8]。以往研究表明，miR-383-5p对前列腺癌等多种癌症的生长具有抑制作用[18]。因此，本研究选择miR-383-5p进行机制研究。有研究表明，MALAT1下调后可通过与miR-383-5p直接作用来调节人脐静脉内皮细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭[19]。本研究发现，MALAT1也可以通过与hPDLSCs中miR-383-5p结合发挥作用，下调MALAT1表达可明显上调miR-383-5p表达。此外，LPS刺激后，hPDLSCs中miR-383-5p表达降低，提示MALAT1可能通过miR-383-5p参与牙周炎发展过程。进一步研究发现，抑制miR-383-5p表达可部分减弱MALAT1敲低对hPDLSCs的影响，表明MALAT1可能通过海绵化miR-383-5p对牙周炎产生影响。miR-383-5p的靶基因是SOCS3。脱氢丁香酚可通过抑制STAT3/SOCS3通路改善LPS诱导的哮喘模型肺部炎症[20]；SOCS3还被证实可作为骨髓间充质干细胞成骨分化和骨形成的负调节因子[21]。Wang等[10]研究证实，降低SOCS3的表达可抑制衰老相关分泌表型，进而抑制糖尿病小鼠牙周炎症的发展。本研究结果显示，LPS诱导的hPDLSCs中SOCS3表达升高，且miR-383-5p可靶向调控SOCS3表达，而过表达SOCS3可部分逆转MALAT1敲低后对hPDLSCs细胞的影响，证实了下调MALAT1通过调控miR-383-5p/SOCS3轴减弱LPS诱导的hPDLSCs炎症损伤。

综上，本研究首次提供证据表明，下调MALAT1通过miR-383-5p减少SOCS3表达，抑制LPS诱导的hPDLSCs炎症和凋亡，促进hPDLSCs增殖和成骨分化。这可能为未来牙周炎靶向治疗方案的发展提供新的实验依据。然而，本研究仅在细胞层面对MALAT/miR-383-5p/SOCS3机制进行了探究，仍需在体内进一步研究验证；其次，SOCS3如何在hPDLSCs中发挥作用仍有待进一步探索。