消退素D2对CVB3诱导的病毒性心肌炎小鼠心肌细胞凋亡的保护作用及机制研究

石哲玮 钱彩珍 刘胜新 秦铖璠 宣婧婧

病毒性心肌炎是一种由病毒感染引起的心脏炎症性疾病[1]。自然界内几乎所有的病毒感染都可引起病毒性心肌炎，其中以呼吸道和肠道病毒最为多见。柯萨奇B3病毒（Coxsackievirus B3,CVB3）引起心肌炎约占所有病毒的40%～45%。由于目前临床上缺乏有效的治疗手段，所以暴发性心肌炎患者的死亡率仍较高[2]。寻找能够有效缓解病毒感染引起心脏损伤的药物有望降低病毒性心肌炎患者的死亡率。细胞凋亡被认为是一种由基因调控的细胞自主、有序的死亡模式，其已被证明参与了病毒性心肌炎的发生、发展过程[3]。同时，细胞凋亡程度与病毒性心肌炎小鼠的预后具有相关性。抑制CVB3感染引起的心肌细胞凋亡可减轻病毒性心肌炎小鼠的心肌损伤并改善心肌重构[4]。

消退素是一类具有促进机体内炎症消退作用的多不饱和脂肪酸衍生物[5]。D类消退素（Resolvin D,RvD）是消退素家族的重要组成部分。既往研究表明，RvD1可抑制内质网应激诱导的细胞凋亡[6]；同时，RvD1可抑制氧化应激损伤诱导的细胞凋亡从而减弱巨噬细胞的胞吞作用[7]。本研究通过检测RvD2治疗后病毒性心肌炎小鼠心肌组织凋亡程度和凋亡相关通路蛋白磷酸化水平以明确RvD2对心肌细胞凋亡的调控作用，现将结果报道如下。

1 材料和方法

1.1 实验材料和动物 CVB3 Nancy株由美国ATCC公司提供，所用Hep2细胞经由中国科学院上海生科院细胞资源中心鉴定并提供。本研究通过向体外培养的Hep2细胞的培养基中加入CVB3病毒从而使CVB3活化增殖。待CVB3病毒造成75%的Hep2细胞损害时收集病毒，测定CVB3病毒滴度并稀释至107TCID50/0.1 ml[8]。雄性BALB/c小鼠均购自上海斯莱克实验动物有限公司［SCXK（沪）2012-0002］，饲养于温州医科大学实验动物中心［SYXK（浙）2015-0009］。

1.2 实验试剂及仪器 RvD2购自美国Cayman chemical公司（批号：10007279，规格：50 μg）；SC66购自美国MCE公司（批号：HY-19832，规格：5 mg）；兔抗小鼠甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH；批号：#5174，规格：100 μl）、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（serine/threonine-protein kinase,AKT；批号：#4685，规格：100 μl）、p-AKT（批号：#4060，规格：100 μl）、半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3；批号：#9662，规格：100 μl）、B 淋巴细胞瘤-2基因（B-cell lymphoma-2，Bcl-2；批号：#3498，规格：100 μl）和Bcl-2关联X蛋白（Bcl-2-associated X protein,Bax；批号：#14796，规格：100 μl）单克隆抗体均购自美国CST公司；山羊抗兔IgG抗体（批号：BS13278，规格：100 μl）购自美国Bioworld公司；病理染色试剂盒（批号：G1120，规格：100 ml）、蛋白浓度检测试剂盒（批号：PC0020，规格：50T）购自北京Solarbio公司；Multiskan SkyHigh酶标仪购自美国赛默飞公司；BX43生物显微镜购自日本奥林巴斯公司。

1.3 方法

1.3.1 病毒性心肌炎动物模型构建 雄性BALB/c小鼠40只，通过随机数字表法分为正常对照组、病毒性心肌炎组、RvD2治疗组、AKT抑制剂处理组，每组10只。正常对照组小鼠予腹腔注射0.2 ml、0.9%氯化钠溶液作为对照。其余3组小鼠均腹腔接种含1.0×106滴度的CVB3病毒液0.2 ml，构建病毒性心肌炎动物模型；腹腔接种CVB3 6 h后，予RvD2治疗组小鼠腹腔注射RvD2 0.25 ng·g-1·d-1，AKT抑制剂处理组小鼠腹腔注射 RvD2 0.25 ng·g-1·d-1和 AKT 抑制剂 5 μg·g-1·d-1。药物处理7 d后处死4组小鼠，留取心脏组织和血清标本。

1.3.2 小鼠心肌组织病理染色及评分 将正常对照组、病毒性心肌炎组、RvD2治疗组小鼠心尖部心肌组织固定于4%多聚甲醛中。24 h后，冲洗残留的多聚甲醛。脱水、石蜡包埋后制成含心肌组织的蜡块，HE染色。由资深的病理科医师对各组小鼠心肌组织中炎症细胞分布情况进行评分：0分为无炎症细胞浸润；1分为浸润面积0～＜25%，2分为浸润面积25%～＜50%,3分为浸润面积50%～＜75%；4分为浸润面积75%～100%。

1.3.3 小鼠血清肌钙蛋白I（cardiac troponin I,cTnI）和B型脑钠肽（brain natriuretic peptide,BNP）水平检测采用ELISA法。将所取血液样本室温放置1 h，静待血液凝固后将其放入离心机中，在4℃温度下2 000 r/min、离心10 min，取上清液，按照ELISA试剂盒步骤检测小鼠血清cTnI和BNP水平。

1.3.4 小鼠心肌组织p-AKT、AKT及凋亡相关蛋白Caspase-3、Bax、Bcl-2水平检测 采用Western blot法。将蛋白裂解液和小鼠心肌组织一同加入组织匀浆管中，将组织搅碎并在低温环境下静置30 min。以12 000 r/min离心30 min，取上清液，测定总蛋白水平。将所配得的蛋白体系通过10%分离胶跑开后，在300 mA恒定电流的条件下转膜90 min，用5%脱脂奶粉封闭 2 h，加入一抗 p-AKT（1∶1 000）、AKT（1∶1 000）、GAPDH（1∶5 000）、Caspase-3（1∶1 000）、Bax（1∶1 000）和Bcl-2（1∶1 000）在4℃冰箱中孵育过夜。第2天取出孵育盒，TBS-Tween洗涤3次，10 min/次，在相应的二抗中孵育2 h，再次用TBS-Tween洗3次，曝光、显影。通过Image J软件分析灰度值，p-AKT蛋白以AKT蛋白条带作参照，Caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白的表达量与GAPDH蛋白量作比较。

1.4 统计学处理 采用SPSS 22.0统计软件。计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用Bonferroni校正的t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组小鼠心脏组织炎症反应评分比较 与正常对照组炎症反应评分比较（0分），病毒性心肌炎组评分[（2.7±0.5）分]升高（P＜0.05）；与病毒性心肌炎组比较，RvD2治疗组评分[（1.3±0.5）分]降低（P＜0.05），见图1。

图1 3组小鼠心肌组织形态学观察及炎症反应评分比较（HE染色，×200）

2.2 3组小鼠血清cTnI和BNP水平比较 与正常对照组比较，病毒性心肌炎组小鼠血清cTnI、BNP水平均增加（均P＜0.05）；而与病毒性心肌炎组比较，RvD2治疗组小鼠血清cTnI、BNP水平均降低（均P＜0.05），见表1。

表1 3组小鼠血清cTnI和BNP表达水平比较（pg/ml）

2.3 3组小鼠心肌组织Caspase-3、Bax、Bcl-2水平比较 与正常对照组相比，病毒性心肌炎组小鼠心肌组织Caspase-3、Bax水平增加，而Bcl-2水平降低（均P＜0.05）；与病毒性心肌炎组相比，RvD2治疗组小鼠心肌组织Caspase-3、Bax水平降低，而Bcl-2水平增加（均P＜0.05），见图2。

图2 3组小鼠心肌组织Caspase-3、Bax和Bcl-2水平比较

2.4 3组小鼠心肌组织AKT蛋白磷酸化水平比较 与正常对照组相比，病毒性心肌炎组小鼠心肌组织内AKT蛋白磷酸化水平上调（P＜0.05）；与病毒性心肌炎组相比，RvD2治疗组小鼠心肌组织AKT蛋白磷酸化水平上调（P＜0.05），见图3。

图3 3组小鼠心肌组织AKT蛋白磷酸化水平比较

2.5 4组小鼠心肌组织AKT蛋白磷酸化水平和Caspase-3、Bax、Bcl-2水平比较 AKT抑制剂处理组小鼠心肌组织AKT蛋白磷酸化水平较RvD2治疗组下调（P＜0.05），Caspase-3、Bax水平较RvD2治疗组增高，而Bcl-2水平降低（均P＜0.05），见图4。

图4 4组小鼠心肌组织AKT蛋白磷酸化水平和Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白水平比较

3 讨论

病毒性心肌炎在我国青少年和40岁以下成年人中多发，是青年患者心源性猝死的重要病因之一[9]。病毒性心肌炎的发病人数表现为逐年上升的趋势，已威胁各国青少年的生命健康。因此，寻找能够有效抑制病毒感染引起的心肌炎症和心脏损伤的药物对病毒性心肌炎患者的治疗具有重要价值。

本课题组前期研究发现RvD2可有效减轻病毒性心肌炎小鼠的炎症反应，本研究进一步阐明了RvD2在病毒性心肌炎小鼠体内对心肌组织凋亡的抑制作用。细胞凋亡被认为是一种细胞的程序性死亡。由于心肌细胞是人体内的一种不可再生细胞，所以随着心肌细胞死亡数量的增加，心脏功能受到显著影响。既往研究表明，通过抑制心肌组织凋亡可发挥心脏保护作用。Sang等[10]的研究表明褪黑素可通过调节心肌细胞凋亡和自噬来减少CVB3感染引起的心肌损伤；Liu等[11]的研究表明给予病毒性心肌炎小鼠黄芪甲苷Ⅳ治疗可减少心肌细胞凋亡，从而减少小鼠的死亡率。本研究通过ELISA法检测了小鼠血清中cTnI、BNP水平，Western blot法检测了小鼠心肌组织内Caspase-3、Bcl-2和Bax水平。结果表明RvD2可降低病毒性心肌炎小鼠血清中cTnI、BNP水平，同时降低心肌组织中Caspase-3、Bax水平，增加Bcl-2水平。由此可见，RvD2可有效减少CVB3诱导的心肌损伤，同时抑制病毒性心肌炎小鼠心肌组织凋亡，从而发挥其心脏保护作用。

为了进一步阐明RvD2在调控病毒性心肌炎小鼠心肌组织凋亡过程中的信号转导机制，本研究通过Western blot法检测凋亡相关通路蛋白磷酸化水平。既往研究表明，PI3K/AKT通路在细胞凋亡的调控过程中发挥重要作用[12]。Zhang等[13]的研究结果表明RvD2对AKT蛋白磷酸水平具有显著的上调作用。本研究结果表明，在病毒性心肌炎小鼠体内RvD2可上调心肌组织内AKT蛋白的磷酸化水平。在给予AKT抑制剂处理后，RvD2对AKT蛋白磷酸化水平的上调作用受到显著抑制，Caspase-3、Bax水平上调，Bcl-2水平下调。由此可见，RvD2可通过调控AKT信号通路影响心肌组织凋亡水平。

综上所述，本研究结果表明腹腔注射RvD2治疗可有效抑制病毒性心肌炎小鼠血清中cTnI、BNP水平，减少心肌组织内凋亡相关蛋白水平，抑制心肌组织凋亡的发生，通过抑制AKT蛋白磷酸化水平可逆转RvD2的抗凋亡作用。本研究证明RvD2可通过激活AKT信号通路降低心肌细胞凋亡程度，从而改善病毒性心肌炎小鼠的症状并降低其死亡率，预期可为病毒性心肌炎提供新的治疗药物。

但本研究也存在不足之处。首先，对心肌细胞凋亡的检测方法较为单一，后续可增加荧光染色技术，从而更加全面评估心肌细胞凋亡情况；其次，对于信号调控通路的研究尚不全面，后续可增加对AKT上下游蛋白的检测，从而更好地阐明RvD2的抗凋亡机制。