羊口疮病毒115基因的克隆及原核表达

林裕胜，黄丽丽，江锦秀，张靖鹏，刘维巍,，刘庆华，胡奇林*

（1.福建省农业科学院畜牧兽医研究所，福建 福州 350013；2.新疆生产建设兵团第十一师第五中学，新疆 乌鲁木齐 830000；3.福建农林大学动物科学学院，福建 福州 350002）

0 引言

【研究意义】羊口疮（Orf）是羊口疮病毒（Orf virus，ORFV）引起的一种接触性、嗜上皮性的人畜共患病，给养羊业造成较大的危害，已经成为养羊业健康发展的主要疫病之一。我国新疆、内蒙古、甘肃、湖北和福建等地均有报道。该病一年四季均可发病，春秋季节最为多发。目前，在Orf的治疗方面，临床上仍无有效的抗病毒药物，主要依靠接种疫苗、药物治疗及加强饲养管理防治该病。但是，现有疫苗免疫效果不理想[1]。因此，迫切需要从分子水平探讨ORFV感染和致病机理，利用现代基因工程技术，寻找安全有效的防治方法。【前人研究进展】ORFV为痘病毒科（Poxviridae）副痘病毒属（Parapoxvirus）的代表种[2-3]。ORFV病毒基因组大小长约134～139 kb，鸟嘌呤和胞嘧啶占比（GC含量）为64%，至少包含134个基因编码区（ORF），具有封闭的末端发夹结构，基因组中央编码区ORF009～ORF111高度保守，负责调节病毒的复制、形态和结构；两端重复序列ORF001～ORF008和ORF112～ORF134，与免疫调节、免疫逃逸和病毒毒力等相关，比如ORFV编码的病毒白细胞介素10（127）能够抑制宿主的炎症反应，干扰素抑制蛋白（020）能够抑制宿主细胞分泌的干扰素作用，趋化因子结合抑制蛋白（112）能够抑制宿主免疫细胞的运输， 血管内皮生长因子（132）能够增加细胞底物用于病毒自身的复制，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子/白细胞介素2抑制蛋白（117）具有抑制宿主细胞 GM-CSF和IL-2的双重活性，抗细胞凋亡因子（125）通过抑制宿主细胞的凋亡促进病毒的入侵，ANK蛋白（008、123、126、128、129）能够通过 F-box-like 结构域降解宿主的抗病毒因子，从而促进病毒复制和感染不同物种[4-8]；此外ORFV还通过编码多种蛋白（002、024、073、119、121）抑制核转录因子 κB（Nuclear factor-kappa B，NF-κB）信号转导途径的不同过程[9-12]。【本研究切入点】ORFV两侧末端基因多数与病毒的免疫逃避机制和致病机制有关，因此开展末端基因的研究具有重要的价值[9-10]。115基因位于ORFV基因组末端变异区，其潜在功能可能与宿主范围相关；该基因编码的蛋白质是具有亲水性、不稳定性及结构比较松散的蛋白质。【拟解决的关键问题】本研究拟通过克隆ORFV FJND株115基因并进行原核表达，以期为研究ORFV115基因的功能及ORFV致病机制提供研究素材。

1 材料与方法

1.1 试验材料

ORFV FJ-ND株由福建省农业科学院草食动物病研究中心分离、鉴定和保存。原核表达载体pGEX-6P-1、高保真酶 1-5TM2X High Fidelity Master Mix、pMC100-M Top-cloning Mix试剂盒购自齐美欣科生物技术有限公司；PremixTaq（ExTaqVersion 2.0 plus dye）、T4 DNA连接酶、Marker等购自宝生物（大连）工程有限公司； 大肠杆菌（E.coli）DH5α感受态细胞、RosettaganmiB（DE3）感受态、IPTG、X-gal、LB琼脂（肉汤）培养基、Ezup柱式动物基因组DNA抽提试剂盒和质粒提取试剂盒等购自生工生物工程（上海）股份有限公司；凝胶回收试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；限制性内切酶BamHⅠ和SalⅠ购自NEB（北京）有限公司；无内毒素质粒提取试剂盒购自天根生化科技有限公司。

1.2 引物设计

参考GenBank中收录的NZ2株（No.DQ184476.1）115基因序列，利用primer 6.0软件设计1对特异性引物，F: CGGGATCCATGGCGTGTTTTATCGAATG，R: GCGTCGACTCATTCCGAGGAGGAGAAG，分别带BamH Ⅰ和R端SalⅠ的酶切位点。引物委托铂尚生物技术（上海）有限公司合成。

1.3 115基因克隆

按照生工生物工程（上海）股份有限公司提供的Ezup柱式动物基因组DNA抽提试剂盒说明书提取ORFV FJ-ND株DNA，以抽提的DNA为模板，用设计的特异性引物进行PCR扩增。扩增体系为：高保真酶 1-5TM2X High Fidelity Master Mix 10 μL，上、下游引物 10 μmol·L-1各 1 μL，模板 2 μL，RNase-Free H2O 6 μL，反应程序为：95 ℃ 2 min；95 ℃ 15 s，55 ℃15 s，72 ℃ 15 s，34个循环；72 ℃ 7 min。目的片段经胶回收后连接至pMC100-M载体上，并转化至大肠杆菌（E.coli）DH5α感受态细胞，验证正确的阳性克隆并送至铂尚生物技术（上海）有限公司进行测序。

1.4 原核表达载体的构建

将pGEX-6P-1质粒和克隆质粒pMC100-M-115同时进行双酶切，胶回收酶切产物，经T4连接酶后转化至大肠杆菌（E.coli）DH5α感受态细胞，均匀涂布于含有Amp抗性的LB琼脂平板上，通过菌液PCR、双酶切鉴定，鉴定正确的菌液进行扩大培养并提取其质粒，随后送铂尚生物技术（上海）有限公司进行测序鉴定。

1.5 重组蛋白的诱导表达

将pGEX-6P-115阳性质粒通过热激法转化导入表达菌株RosettaganmiB（DE3）感受态，划线接种于含Amp的LB琼脂培养基中，37 ℃过夜培养，挑取过夜培养的单个菌落于含Amp的新鲜LB肉汤培养基中，37 ℃ 220 r·min-1振荡过夜培养。取过夜培养物 3 mL按 1∶100的比例转接于 300 mL含 Amp的LB液体培养基中继续培养，测OD600nm约为0.6时加入终浓度为1.0 mmol·L-1的IPTG诱导4 h后取1 mL 诱导产物，于 4 ℃、8 000 r·min-1离心 5 min 收集菌体沉淀，用1×PBS清洗菌体沉淀3次，最后加入100 μL DEPC水重悬沉淀，SDS-PAGE蛋白电泳检测，并设置诱导和未诱导的空载菌、未诱导的重组菌做阴性对照，以确定蛋白表达情况。在重组菌初步诱导表达后，37 ℃条件下分别设置不同IPTG诱导浓度和诱导时间，即IPTG终浓度为0.4 、0.6、0.8和1.0 mmol·L-1条件下进行诱导，确定最佳IPTG诱导浓度；重组菌在最佳IPTG诱导浓度条件下，设置不同的诱导时间，即在2 、3、4、5和6 h条件下进行诱导，其他条件保持不变，确定最佳诱导时间。

1.6 重组蛋白的可溶性分析

重组诱导菌经 4 ℃、8 000 r·min-1离心 5 min 收集菌体沉淀，用1×PBS清洗菌体沉淀3次，加入30 mL的DEPC水重悬沉淀，重悬菌体沉淀经超声破碎（超声5 min，工作3 s，间歇4 s，保护温度25 ℃，功率30%，共超声破碎20～30 min），超声后的菌体经4 ℃、10 000 r·min-1离心5 min，分离上清和沉淀，并向沉淀中加入3 mL DEPC水混匀，取少量样品进行10倍稀释，其余样品-20 ℃保存。取稀释后的沉淀及破碎后分离的上清，加入4×SDS Buffer用移液枪吹打混匀，沸水煮6 min ，样品冷却后进行SDSPAGE检测。

1.7 重组蛋白的纯化

根据北京天恩泽基因科技有限公司包涵体纯化试剂盒进行蛋白纯化。

2 结果与分析

2.1 115基因PCR扩增与克隆

以ORFV FJ-ND株DNA为模板， PCR扩增115基因，经1%琼脂糖凝胶电泳后可见1条450 bp左右条带，与预期目的片段大小相符（图1）。目的片段经胶回收后连接至pMC100-M载体上，克隆质粒pMC100-M-115经酶切得到450 bp左右的片段，测序结果与GenBank中公布的15株ORFV全基因组序列的115基因序列比较同源性为85.96%～98.89%。

2.2 重组质粒鉴定

挑单菌落接种LB液体培养基中37 ℃培养，然后提取质粒，以质粒为模板进行质粒PCR， 扩增条带大小与预期相符（图2），用BamHⅠ和SalⅠ双酶切质粒，分别得到一个约5 000 bp条带，与 pGEX-6P-1大小相等；另一个片段约450 bp，与目的片段大小相符（图3）。

2.3 阳性重组菌诱导表达

pGEX-6P-115重组菌在37 ℃下通过对表达时间和IPTG终浓度条件进行优化，SDS-PAGE检测结果显示37 ℃ IPTG终浓度为1 mmol·L-1、诱导表达4 h为重组蛋白的最佳诱导表达条件（图4、5）。

2.4 表达蛋白的可溶性分析

重组菌经诱导表达后，重悬菌体沉淀经超声破碎，分离上清和沉淀并进行SDS-PAGE检测，结果（图6）发现重组菌破碎后上清中未出现目的蛋白条带，在沉淀中出现42 kDa左右的条带，与预期结果相符，表明重组蛋白主要以包涵体形式存在。

2.5 重组蛋白纯化结果

诱导表达得到的重组菌经处理后，使用北京天恩泽基因科技有限公司生产的包涵体纯化试剂盒进行纯化，纯化后的重组蛋白经SDS-PAGE电泳检测，结果如图7所示，在42 kDa左右处出现目的蛋白条带，且主带突出，几乎无其他杂带。

3 讨论与结论

在长期的进化过程中，ORFV基因组编码一系列免疫调节和致病性相关基因，通过各种表达产物限制宿主的免疫清除，致使该病疫苗免疫效果不理想，此外ORFV的毒性基因功能尚未完全明确，其致病机理还有待于进一步阐明。虽然目前已鉴定了多个ORFV的末端基因，如002、112、121和127等，其靶标主要为宿主的细胞因子、趋化因子和NF-κB信号途径等[9-12]，这些基因协同作用使ORFV具有很强的免疫调节作用[13]；但仍有些毒性基因的功能不太清楚，如009、016和115基因等[14]。

本研究通过设计特异性引物，采用PCR技术扩增出ORFV FJ-ND株115基因，将其克隆至pMC100-M克隆载体上，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，并进行蓝白筛选，挑取阳性克隆子，提取其质粒，通过PCR、双酶切鉴定以及测序进行验证。测序结果显示 ORFV FJ-ND株115基因全长 450 bp，编码149个氨基酸。随后将115基因连接到pGEX-6P-1原核表达载体并转化至大肠杆菌RosettaganmiB（DE3）中进行表达；通过对IPTG诱导浓度和诱导时间进行优化以确定最佳表达条件，表达产物纯化后进行SDS-PAGE，结果显示，在37 ℃下最佳诱导表达时间4 h和IPTG终浓度为1 mmol·L-1；重组蛋白大小约为42 kDa；可溶性分析结果表明该重组蛋白主要以包涵体形式存在，这可能与该原核表达载体结构有关；利用包涵体纯化试剂盒进行纯化，经SDS-PAGE电泳检测，已纯化出单一目的蛋白。本研究结果为下一步制作单克隆抗体以及细胞表位筛选打下坚实基础。ORFV两侧末端基因具有较高的中间变异性，且大多数与病毒的致病机制有关，因此开展末端变异区的研究对于解析该病毒致病机制具有重要作用[15]。通过对GenBank中公布的15株ORFV全基因组序列进行对比发现，15株ORFV008基因之间相似性在94.20%以上，15株ORFV113基因之间相似性在94.20%以上，15株ORFV121基因之间相似性在90.88%以上，15株ORFV122基因之间相似性在94.88%以上，15株ORFV115基因之间的相似性在85.96%以上。ORFV末端基因（008、019、020、023、121、122、127）原核表达蛋白多以包涵体形式存在，然而包涵体的形成原因较为复杂，除了外界因素可以影响其形成外，还与蛋白内部是否存在信号肽等结构也有较大关系。据报道信号肽结构有利于提高蛋白质的可溶性，无信号肽结构可能因可溶性较低而更容易形成包涵体[16]。

综上，本研究克隆了ORFV115基因，成功构建了pGEX-6P-115原核表达质粒，优化了重组蛋白表达条件并进行纯化，将为进一步探索ORFV 115蛋白在感染宿主过程中的机制和作用奠定基础。