基于苋菜转录组的TCP基因家族成员鉴定及表达分析

安子贤，李宜轩，郑友峰，肖 昉，王 乐，陈 何，赖钟雄，牟建梅，刘生财*

（1.福建农林大学园艺植物生物工程研究所，福建 福州 350002；2.苏州市农业科学院，江苏 苏州 215000）

0 引言

【研究意义】苋菜（Amaranthus tricolorL.）属石竹目苋科苋属富含甜菜色素的一年生双子叶草本植物[1-3]，环境条件对苋菜的营养品质和产量具有重要影响。因此，探究非生物胁迫对苋菜产量及品质的影响具有重要意义。【前人研究进展】TCP是植物特有的一类转录因子，由TB1（TEOSINTE BRANCHED1）、CYC（CYCLOIDEA）和PCFs（PCF1、PCF2）3个成员组成，含有59个氨基酸，其主要特征在于其N端含有一个高度保守的bHLH结构域，该结构域又称为TCP结构域[4]。在模式植物拟南芥中，TCP基因主要对花、芽和叶片的生长发育起到调控作用，参与信号转导，对细胞有一定的调控作用，同时响应多种非生物胁迫应答反应。研究发现，多数柳枝稷TCP基因对盐胁迫有响应，并且在盐胁迫条件下表现出不同的表达谱[5]；在菜豆研究中发现， TCP 基因与盐胁迫相关[6]；李佳皓等[7]研究证实马铃薯TCP对盐胁迫下马铃薯的生长发育有一定的调控作用。TCP基因与miR319二者对甘蓝型油菜盐胁迫均有响应，TCP靶基因的表达受到miR319的控制进而调控植株的耐盐性[8]；TCP参与植物器官的形态发育及细胞分裂的调控等[9-10]；任丽[11]对白桦TCP基因的研究证实了BpTCP3在白桦的不同部位均有表达，尤其在根部表达量最为显著。【本研究切入点】TCP在陆地植物、藻类植物和苔藓植物当中均有发现，并且对于植物中TCP基因的研究非常广泛[12]。目前，在拟南芥[13]、马铃薯[14]、茄子[15]、水稻[16]、高粱[9]和玉米[17]等园艺植物中对TCP在其物种中的作用和功能均有研究。但TCP基因在苋菜中的表达情况及功能尚不明确。【拟解决的关键问题】对苋菜TCP基因家族进行筛选鉴定，探讨不同条件下TCP基因表达情况，为探究该家族基因在非生物胁迫条件下对苋菜产量和品质的影响奠定基础，为调控苋菜生长发育过程提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与处理

苋菜种子为苏苋1号，由苏州市农业科学院提供。采用纸床法，将种子播种在培养皿中，分别进行NaCl盐胁迫（0、50、100 、200 mmol·L-1）、不同铵硝比（二者浓度为0∶0、0∶10、3∶7、5∶5、7∶3、10∶0），分 别 用 NCK、 N1、 N2、 N3、 N4、 N5表 示 ）[18]及黑暗和蓝光培养，培养温度（25 ±2） ℃，除黑暗条件下培养外，其他处理光照时间为16 h/8 h（光/暗）。培养5 d后取整株苋菜进行RNA提取用于后续试验。苋菜不同组织部位采用30 d盆栽苗，分别取根、茎、叶进行RNA提取用于qRT-PCR分析。

1.2 试验方法

1.2.1 数据来源及AtrTCP家族基因的鉴定 数据来源于大红苋菜胚轴的转录组数据库（登录号SRA：SRR5930345），该数据库由本实验室课题组获得，基因筛选方法参考王乐等[19]基因鉴定方法，通过Nr、Nt、Swissprot和Pfam 4个数据库筛选基因，在筛选时输入“TCP”进行筛选，得到初筛基因，并利用SMART（https://smart.embl-heidelberg.de/）和NCBI（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）对初筛基因进行筛选及鉴定。

1.2.2AtrTCP基因家族蛋白生物信息学分析及保守结构域分析 利用ExPASy-ProtParam tool（https://web.expasy.org/protparam/）、SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）、Plant-mPLoc Server（http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/#）和 MEME Suite 5.1.0（http://meme-suite.org/tools/meme）等在线软件对AtrTCP蛋白序列的理化性质、蛋白质二级结构、亚细胞定位和保守基序进行分析；利用TBtools、MEGA-X、DNAMAN生物信息学分析软件构建系统进化树；利用psRNATarget（http://plantgrn.noble.org/psRNATarget/）在线软件对miRNA进行预测。具体分析方法参照王乐等[19]方法进行基因家族分析。

1.2.3 不同条件处理苋菜幼苗及qRT-PCR分析 通过纸床法对苋菜幼苗在盐胁迫、硝铵配比及黑暗和蓝光下进行处理，在培养皿中放置3层滤纸，分别加入5 mL处理液，以ddH2O为对照组，除黑暗和蓝光处理外，其余处理均放在16 h/8 h（光/暗）培养室中进行培养；苋菜放在黑暗和蓝光下进行处理，处理5 d后进行取样。使用天漠科技开发有限公司（北京）提供的总RNA提取试剂盒提取不同浓度盐胁迫、硝铵配比以及黑暗、蓝光处理条件下的苋菜总RNA，经过逆转录得到cDNA模板，利用DNAMAN软件进行引物设计，该基因组定量引物及内参引物（EF1a）设计见表1，该引物由铂尚生物技术有限公司（福州）合成。qRT-PCR结果分析根据2-ΔΔCt法计算基因表达量。

表1 AtrTCP定量引物Table 1 Quantitative primers of AtrTCP

2 结果与分析

2.1 苋菜TCP基因家族的鉴定

基于苋菜转录组数据，通过SMART筛选以及NCBI比对后，最终得到14个TCP家族成员基因，依次命名为AtrTCP1~AtrTCP14（表2）。通过对TCP基因家族成员进行理化性质分析，结果显示AtrTCP蛋白质长度在230~721 aa，相对分子量为25.25~78.57 kD，等电点为6.15~9.45；AtrTCP11为稳定蛋白外，其余均为不稳定蛋白；AtrTCP蛋白全部为亲水蛋白（表2）。在对其蛋白质二级结构分析时发现，无规卷曲比例最高，处于54.91%~71.63%；其次是α-螺旋，为 11.82%~24.23%；延伸链为 10.23%~21.33%；β-转角比例最低，为1.69%~10.95%；对该基因家族亚细胞定位发现全部定位于细胞核中 （表3）。

表2 AtrTCP基因家族理化性质分析Table 2 Physicochemical properties of AtrTCP family

表3 AtrTCP基因家族蛋白质二级结构及亚细胞定位分析Table 3 Protein secondary structures and subcellular localizations of AtrTCP family

2.2 苋菜AtrTCP家族系统进化树分析

根据TCP基因家族进化关系，将TCP基因家族划分为2个亚族：Class I和Class II；Class I为PCF，而Class II划分2个分支CYC/TB1和CIN。通过MEGA-X软件，对筛选得到的14个AtrTCP基因家族成员进行基因家族进化树的构建，根据苋菜AtrTCP基因与模式植物拟南芥AtTCP基因聚类分析发现，Class I亚族中，含有22个TCP家族成员，其中拟南芥12个，苋菜10个；Class II亚族中，CIN分支含有12个TCP家族成员，其中拟南芥8个，苋菜4个；CYC/TB1分支含有4个TCP家族成员，全部为拟南芥。AtrTCP1与AtTCP20、AtrTCP4与AtTCP2、AtrTCP8与AtTCP19、AtrTCP10与AtTCP11和AtrTCP12与AtTCP13基因亲缘关系较近（图1)，表明这5个苋菜AtrTCP基因与拟南芥AtTCP基因具有相似功能。

2.3 苋菜AtrTCP蛋白保守基序分析

通过MEME对AtrTCP蛋白进行保守基序分析，共获得了15个保守基序，依次命名为Motif1~Motif15。所有AtrTCP都含有Motif1基序，Motif1高度保守；除AtrTCP2、AtrTCP4、AtrTCP6和AtrTCP12外，其余AtrTCP均含有Motif2基序，Motif5出现6次，Motif12出现5次，其余蛋白保守基序均少于5次（图2）。结合聚类分析发现，PCF（Class I）亚族成员包含特有的Motif2基序；CIN（Class II）亚族成员均含有Motif3基序（图1、2）。

2.4 调控苋菜AtrTCP的miRNA预测

通过psRNATarget在线软件，以苋菜small RNA数据库为参考，AtrTCP核苷酸序列为待测序列，将筛选得到的14个AtrTCP家族成员进行miRNA预测，结果显示，只有4个AtrTCP家族成员受到miRNA的调控，AtrTCP6和AtrTCP2受到miR319_1、miR319_2、miR319a-3p和 miR319a_1的调控；AtrTCP11和AtrTCP13受到 miR5658的调控（表4）。miRNA的表达趋势结果显示，AtrTCP6和AtrTCP2总体表现为上调趋势。

表4 苋菜AtrTCP基因家族miRNA的预测及差异表达分析Table 4 Prediction and differential expressions of AtrTCP family miRNA

2.5 不同处理下苋菜AtrTCP实时荧光定量PCR分析

2.5.1 盐胁迫下苋菜AtrTCP家族成员qRT-PCR分析NaCl盐溶液处理下的苋菜AtrTCP基因家族各成员qRT-PCR结果显示，AtrTCP2在50 mmol·L-1的处理下表达量最高，随着浓度升高，该基因表达量呈下调趋势；AtrTCP6、AtrTCP11和AtrTCP12的表达量随着盐溶液浓度的升高呈上调趋势，在100 mmol·L-1的处理下表达量达到最高值，而后呈下调趋势；AtrTCP8、AtrTCP9和AtrTCP14的表达量随着盐溶液浓度的升高呈下调趋势；AtrTCP1在200 mmol·L-1的处理下表达量达到最大值；随着浓度的升高，AtrTCP3和AtrTCP10的表达量呈现先下调后上调的趋势；AtrTCP7和AtrTCP13的表达量呈现上调趋势；在不同盐浓度处理下AtrTCP5的表达量无明显变化（图3）。

2.5.2 光质处理下苋菜AtrTCP基因家族qRT-PCR分析 蓝光和黑暗处理下的苋菜AtrTCP基因家族qRT-PCR分析结果显示，AtrTCP1、AtrTCP4、AtrTCP6和AtrTCP10在蓝光条件下表达呈上调趋势，其余成员的表达均呈下调趋势，其中，AtrTCP10基因在蓝光条件下，表达量显著上调；AtrTCP2、AtrTCP3、AtrTCP8、AtrTCP9、AtrTCP11和AtrTCP13表达量下调达到了显著水平（图4）。

2.5.3 不同铵硝比处理下苋菜AtrTCP基因家族成员qRT-PCR分析 不同铵硝比处理下的苋菜AtrTCP基因家族成员qRT-PCR结果显示，AtrTCP2、AtrTCP3、AtrTCP9和AtrTCP10在铵硝比为0∶10和3∶7的表达量显著高于铵硝比为10∶0和7∶3的表达量，其中AtrTCP3在不同铵硝比处理下与NCK对照发现，各处理表达量均上调，且均与NCK有显著差异，参与整个氮代谢；而AtrTCP1则在铵硝比为10∶0和7∶3的表达量更高；AtrTCP4、AtrTCP7、AtrTCP8、AtrTCP10、AtrTCP11、AtrTCP12、AtrTCP13和AtrTCP14在不同铵硝比处理下表达量均下调；AtrTCP5随着铵态氮配比的增大，表达量呈现先下降再上升再下降的趋势，其中，在铵硝比为0∶0的处理下表达量最高，但在0∶10、3∶7、7∶3 和 10∶0 处理下无显著差异（图5）。

2.5.4 苋菜不同组织部位qRT-PCR分析 通过对苋菜不同部位的TCP家族成员进行qRT-PCR分析，结果显示，AtrTCP家族成员AtrTCP3、AtrTCP12在叶部的表达量较高，其余家族成员均在根部的表达量较高（图6）。

3 讨论与结论

TCP转录因子在N段端有着高度保守的结构域，是植物特有的一类转录因子。植物的转录因子数量差异也很大，研究发现，多数植物中存在TCP基因，玉米52个[20]、小麦28个[21]、水稻27个[16]、高粱27个[9]、棉花73个[22]、谷子26个[23]、拟南芥24个[24]和牡丹18个[25]等，而在苋菜中鉴定出14个成员，少于已报道的物种，这说明植物TCP转录因子数量在不同物种间差异比较大，这种现象产生的原因可能是由于苋菜TCP基因来源于转录组数据库，部分基因没有表达，而其他物种均来源于全基因组数据库。

在对不同物种进行生物信息学分析时发现，不同物种中聚类关系越紧密，说明两者很大可能上具有相似的功能，在进化树中发现，AtrTCP1与AtTCP20、AtrTCP4与AtTCP2、AtrTCP8与AtTCP19、AtrTCP10与AtTCP11和AtrTCP12与AtTCP13等5对可能具有相似的功能，其中，AtrTCP1可能与AtTCP20功能相似，参与调控细胞扩增、细胞分裂及细胞分化等[26]；AtrTCP4可能与AtTCP2功能相似，在调控植物叶片形态和大小上发挥着重要作用[27]；AtrTCP8可能与AtTCP19功能相似，参与植物防御[28]；AtrTCP10与AtTCP11具有相似的功能，在调控维管束的发育方面发挥着重要的作用[29]；AtrTCP12可能在调控细胞分裂素信号途径应答方面发挥作用[30]。microRNA（miRNA）作为一种调控植物生长发育以及响应胁迫的内源性小RNA分子存在[31]。miRNA预测发现，AtrTCP基因家族大多均受到miR319的调控，这与芥菜[32]、蝴蝶兰[33]等多种植物相同，miRNA319对植物TCP基因家族的调控具有重要作用，并且已经证实miR319靶向TCP基因[5]，而miRNA和TCP基因家族主要参与叶片的生长发育，对叶片有多层次的调控[34]。本研究发现AtrTCP2和AtrTCP6受多种miRNA调控，主要为miR319。有研究表明，蓝光对于甜菜色素的合成有促进作用[35]，苋菜AtrTCP基因家族成员AtrTCP1、AtrTCP4、AtrTCP6和AtrTCP10在蓝光条件下表达量上调，推测AtrTCP1、AtrTCP4、AtrTCP6和AtrTCP10促进苋菜中甜菜色素的合成，但是TCP转录因子参与甜菜色素的合成机制有待进一步研究。

对苋菜的不同部位qPCR结果分析发现，AtrTCP基因家族中的不同成员对苋菜不同组织部位具有不同表达模式，各成员在根部的表达量均较高，说明TCP直接作用到根部，进而影响整株植物的生长发育。而在茎部中，AtrTCP5表达量最高，其次是AtrTCP3，研究表明，芥菜中ClassⅠ亚族成员在茎的发育过程中发挥着重要作用[32]。AtrTCP12在叶部的表达量最高，AtrTCP2、AtrTCP3和AtrTCP4在叶部也具有较高的表达趋势，这也进一步印证不同物种中亲缘关系较近的植株之间存在相似的功能，TCP基因家族中部分成员在调控植物叶片生长发育过程中发挥着重要作用。

对盐胁迫下苋菜TCP基因定量结果分析发现，高浓度的盐胁迫对苋菜的生长发育有明显的抑制作用，高浓度下植物改变体内通路；而低浓度的盐胁迫对苋菜的生长发育的抑制作用较弱，低浓度下植物体内自身防御系统起作用，而王廷芹等[36]对苋菜幼苗和曾泳怡等[37]对水稻幼苗等对生理研究结果相一致。AtrTCP基因在不同光质、不同硝铵配比处理中发现，AtrTCP对光、非生物胁迫等有不同程度的响应，这与谷子等[23]植物盐胁迫相关研究结果相一致。研究结果为进一步探究TCP基因家族提供依据，并为TCP基因在苋菜生长过程中的作用机制及对苋菜非生物胁迫及发育的影响提供参考。