4份临床样品中羊口疮病毒F1L、B2L和GIF基因的进化分析

林裕胜，刘维巍,，张 龙,，江锦秀，张靖鹏，刘庆华，胡奇林

（1.福建省农业科学院畜牧兽医研究所，福建 福州 350013；2.福建农林大学动物科学学院，福建 福州 350002）

0 引言

【研究意义】羊口疮病毒（Orf virus，ORFV）是羊口疮（Orf）的病原体，属于痘病毒科（Poxviridae）副痘病毒属，同属成员还有牛丘疹性口炎病毒、伪牛痘病毒和新西兰马鹿副痘病毒[1]。ORF主要发生在山羊上，绵羊偶有发生，但在其他动物物种和人身上也有发生的报道，是一种接触性、嗜上皮性的人畜共患病[2-4]。了解ORFV流行毒株主要基因的遗传特性，不仅可以为有效防控该病的发生提供理论依据，还可为后续基因缺失苗的构建及致病机制的解析奠定研究基础。【前人研究进展】ORFV是一个线性双链的DNA分子，基因组长度约138 kb，编码134个基因[5-6]。中心区域高度保守，主要参与病毒复制、转录和病毒结构的形成[7-8]；而末端区域变异性较大，可能与ORFV典型的再感染现象有关，是病毒基因调控宿主先天免疫反应的产物[9]。几乎所有发生该病的国家研究机构都有开展ORFV的基因遗传变异分析，这些研究主要基于囊膜基因（B2L）、F1L基因、病毒干扰素基因（VIR）和血管内皮生长因子（VEGF）基因进行分析[2]。F1L基因编码的F1L蛋白是ORFV 主要的免疫优势抗原，刺激宿主产生免疫应答反应[10]。B2L基因编码的B2L蛋白是一个保守且免疫原性较高的囊膜蛋白，是ORFV的保护性抗原之一[11]。GIF可以抑制巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素2的活性，帮助ORFV在宿主体内存活[12]。【本研究切入点】目前Orf在我国山东、广西、陕西、新疆、河南、黑龙江、云南、安徽、海南、吉林和福建等地均有发生的报道，给养羊户造成了较大经济损失，并且出现了该病感染人病例[13-16]。福建省羊场ORFV的变异情况有待深入探讨。【拟解决的关键问题】选取4份2021年福建省临床样品ORFV检测阳性但未免疫ORFV疫苗的病料，克隆其F1L、B2L和GIF基因并分析了这3个基因的遗传变异情况，为福建省有效防控Orf提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 样品来源与毒株 收集2021年在福建省养羊场发生疑似Orf患羊痂皮，经PCR检测ORFV为阳性但未免疫ORFV疫苗的病料，从中选出具有代表性的4份临床样品进行研究。对选取的4份临床样品按照采集的时间及地点，分别命名为FJ-LJ2021（连江）、FJ-PC2021（浦城）、FJ-FQ2021（福清）、FJ-JY2021（建阳）。

1.1.2 主要试剂 EasyPure Genomic DNA Kit、pEASY®-Blunt Zero Cloning Kit（北京全式金生物技术有限公司）；CataAmp High Fidelity PCR Mix（北京开拓思生物技术有限公司）；DNA Marker[宝生物（北京）工程有限公司]；凝胶回收试剂盒[天根生化科技（北京）有限公司]。

1.2 试验方法

1.2.1 引物设计与合成 参考GenBank中收录的NZ2株（No.DQ184476.1）FIL、B2L和GIF基因序列，利用Oligo 7.0软件分别设计特异性引物，引物序列见表1，引物委托铂尚生物技术（上海）有限公司合成 。

1.2.2 样品处理 在生物安全柜中将每份嘴唇部痂皮用剪刀剪碎，按1∶5的体积比加入PBS研磨成浆，将研磨后的匀浆于-20 ℃冷冻保存。经冻融3次后5 000 r·min-1离心15 min，取上清液备用。

1.2.3 核酸提取 按照北京全式金生物生物技术有限公司EasyPure Genomic DNA Kit说明书分别提取上清液的DNA。

1.2.4 4份临床样品ORFVFIL、B2L和GIF基因扩增高保真酶1-5TM2X High Fidelity Master Mix 10 μL，F1L、B2L和GIF基因上、下游引物（10 μmol·L-1)各 1 μL，1.2.3 中提取的 DNA 各 2 μL，RNase-Free H2O 补足 20 μL，反应程序为：95 ℃ 预变性 5 min；95 ℃热变性 30 s，退火温度分别按表1中的温度30 s，72 ℃ 延伸 15 s，35 个循环；72 ℃ 终延伸 7 min。

表1 引物序列Table 1 Sequences of primers

1.2.5 4份临床样品ORFVFIL、B2L和GIF基因序列测定 目的片段经胶回收后分别连接至pEASY®-Blunt Zero Cloning载体上，并转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，验证正确的阳性克隆并送至铂尚生物技术（上海）有限公司进行测序。

1.2.6 4份临床样品ORFVFIL、B2L和GIF基因序列分析 序列经拼接后上传至GenBank，利用Lasergene.v7.1和MEGA7.0软件分别对4份临床样品ORFVF1L、B2L和GIF基因的核苷酸及推导的氨基酸序列与GenBank中16株ORFV全基因序列和1株中国疫苗株B2L基因序列（表2）分别进行比对并构建遗传进化分析树。

表2 ORFV 参考毒株Table 2 Reference ORFV strains

2 结果与分析

2.1 4份临床样品中ORFV F1L基因核苷酸、推导的氨基酸序列相似性分析

FJ-LJ2021（连 江 ）、 FJ-PC2021（浦 城 ）、 FJFQ2021（福 清 ）、 FJ-JY2021（建 阳 ）中 的 ORFVF1L基因序列已提交到GenBank，登录号分别为ON093189、 ON093190、 ON093191 和 ON093192。MegAlian比对分析结果显示4份临床样品中ORFV的F1L基因均由1 029个核苷酸组成，编码343个氨基酸。4份临床样品中ORFVF1L基因核苷酸及其推导的氨基酸序列相似性分别为98.0%～98.8%和98.0%～99.1%；与国内（NP、YX、GO、SJ1、CL18、SY17、NA17、GZ18、OV-HN3/12和 NA1/11）株核苷酸及其推导的氨基酸序列的相似性分别为97.4%～99.4%和97.0%～99.7%；与国外（OV-SA00、0VIA82、TVL和MP）株核苷酸及其推导的氨基酸序列相似性分别为97.5%～98.6%和96.7%～99.4%；与德国D1701弱毒株核苷酸及其推导的氨基酸序列相似性分别为96.5%～96.8%和95.0%～96.2%，与NZ2参考株核苷酸及其推导的氨基酸序列相似性分别为97.7%～98.1%和96.7%～97.9%。

2.2 4份临床样品中ORFV F1L基因的遗传进化树分析

MEGA7.0构建的遗传进化树结果显示4份临床样品中的ORFV与福建（NP、YX、GO和SJ1）株、吉林CL18株、美国OV-SA00株及印度MP株处于同一进化分支上，与吉林（NA17和GZ18）株、广州（OV-HN3/12和 NA1/11）株、美国（OV-IA82和TVL）株和新西兰NZ2参考株在相邻分支上，亲缘关系较近；与吉林SY17株和德国D1701弱毒株在不同分支上亲缘关系较远（图1）。

2.3 4份临床样品中ORFV B2L基因核苷酸、推导的氨基酸序列相似性分析

FJ-LJ2021（连 江 ）、 FJ-PC2021（浦 城 ）、 FJFQ2021（福清）、FJ-JY2021（建阳）中的ORFVB2L基因序列已提交到GenBank，登录号分别为ON093185、ON093186、ON093187和 ON093188。MegAlian比对分析结果显示4份临床样品中ORFV的B2L基因均由1 137个核苷酸组成，编码379个氨基酸。4份临床样品中ORFVB2L基因核苷酸及其推导的氨基酸序列相似性分别为98.4%～99.5%和98.4%～99.7%；与国内（NP、YX、GO、SJ1、CL18、SY17、NA17、GZ18、OV-HN3/12和NA1/11）株核苷酸及其推导的氨基酸序列的相似性分别为97.4%～99.9%和97.9%～100%；与国外（OV-SA00、0VIA82和MP）株核苷酸及其推导的氨基酸序列相似性分别为97.9%～98.9%和97.4%～98.9%；与德国D1701弱毒株核苷酸及其推导的氨基酸序列相似性分别为98.0%～98.7%和98.1%～98.7%，与NZ2参考株核苷酸及其推导的氨基酸序列相似性分别为97.5%～98.1%和97.6%～98.4%，与中国疫苗株核苷酸及其推导的氨基酸序列相似性分别为97.7%～98.1%和97.4%～97.6%。

2.4 4份临床样品中ORFV B2L基因的遗传进化树分析

MEGA7.0构建的遗传进化树结果显示4份临床样品中的ORFV分成3个分支，其中FJ-LY2021和FJ-PC2021与吉林（NA17和CL18）株处于同一进化分支上，FJ-FQ2021与福建SJ1株处于同一进化分支上， FJ-LJ2021与吉林SY17株和印度MP株在同一进化分支上；4份临床样品中的ORFV均与美国OVIA82株、新西兰NZ2参考株和中国疫苗株在不同分支上亲缘关系较远（图2）。

2.5 4份临床样品中ORFV GIF基因核苷酸、推导的氨基酸序列相似性分析

FJ-LJ2021（连 江 ）、 FJ-PC2021（浦 城 ）、 FJFQ2021（福 清 ）、 FJ-JY2021（建 阳 ）中 的 ORFVGIF基因序列已提交到GenBank，登录号分别为ON093181、 ON093182、 ON093183 和 ON073184。MegAlian比对分析结果显示4份临床样品中ORFV的GIF基因均由798个核苷酸组成，编码265个氨基酸。4份临床样品中ORFVGIF基因核苷酸及其推导的氨基酸序列相似性分别为97.2%～99.6%和97.7%～99.6%；与国内（NP、YX、GO、SJ1、CL18、SY17、NA17、GZ18、OV-HN3/12和 NA1/11）株核苷酸及其推导的氨基酸序列的相似性分别为95.7%～99.0%和94.7%～99.2%；与国外（OV-SA00、0VIA82和MP）株核苷酸及其推导的氨基酸序列相似性分别为95.6%～98.0%和95.1%～98.9%；与德国D1701弱毒株核苷酸及其推导的氨基酸序列相似性分别为96.0%～96.4%和88.7%～89.4%，与NZ2参考株核苷酸及其推导的氨基酸序列相似性分别为95.9%～96.1%和95.1%～96.6%。

2.6 4份临床样品中ORFV GIF基因的遗传进化树分析

MEGA7.0构建的遗传进化树结果显示4份临床样品中的ORFV均在同一分支上，与广州GZ18株、吉林NA17株、福建（GO和YX）株、美国OV-SA00株和印度MP株处于同一进化分支上，亲缘关系较近；与吉林（CL18和SY17）株、广州（OV-HN3/12和NA1/11）株、美国（OV-IA82和TVL）株和新西兰NZ2参考株处于相邻分支上，与德国D1701弱毒株亲缘关系最远（图3）。

3 讨论与结论

由于Orf在绵羊和山羊中的发病率较低，在世界范围内普遍被忽视。早期研究数据表明福建省羊场该病的发病率为10.0%～72.0%，致死率为10.5%～20.0%[13-14]，近年来Orf的发病率和致死率相对较低，尚未引起福建省养殖企业的重视。然而由于该病存在人畜共患风险，且近年来关于人感染该病的报道时有发生[1-2,16]，为此，解析ORFV的遗传变异情况对于福建省科学防控该病具有重要的理论依据。

已有的研究表明，ORFVB2L基因和F1L基因位于基因组的高度保守区域，通常作为检测和构建遗传进化树的首选基因[9,11,16-17]。本研究克隆了2021年福建省部分羊场ORFVB2L和F1L基因，获得的序列上传至GenBank中，得到了相应序列号，同时与当前GenBank中收录的国内外16株ORFV全基因组进行比对分析并构建遗传进化树，结果显示4份临床样品中ORFV的F1L基因核苷酸序列相似性为98.0%～98.8%；与国内流行毒株核苷酸序列相似性为97.4%～99.4%；与国外流行毒株核苷酸序列相似性为97.5%～98.6%；与德国D1701弱毒株核苷酸序列相似性为96.5%～96.8%，与NZ2参考株核苷酸序列相似性分别为97.7%～98.1%。遗传进化树结果显示FJ-LY2021与福建（NP、YX和GO）株亲缘关系较近，FJ-FQ2021与吉林GZ18株亲缘关系较近，FJLJ2021与福建SJ1株亲缘关系较近，FJ-PC2021株与印度MP亲缘关系较近；4份临床样品中ORFV均与吉林SY17株和德国D1701弱毒株亲缘关系较远。4份临床样品中ORFVB2L基因核苷酸序列相似性为98.4%～99.5%；与国内流行毒株核苷酸序列的相似性为97.4%～99.9%；与国外流行株核苷酸序列相似性为97.9%～98.9%；与德国D1701弱毒株核苷酸序列相似性为98.0%～98.7%，与NZ2参考株核苷酸相似性为97.5%～98.1%，与中国疫苗株核苷酸序列相似性为97.7%～98.1%。遗传进化树结果显示FJLY2021和FJ-PC2021与吉林（NA17和CL18）株亲缘关系较近，FJ-FQ2021与福建SJ1株亲缘关系较近，FJ-LJ2021与吉林SY17株和印度MP株亲缘关系较近；4份临床样品中ORFV均与美国OV-IA82株、新西兰NZ2参考株和中国疫苗株在不同分支上，亲缘关系较远。由此可见，2021年福建省部分羊场ORFV流行情况较为复杂，祖先来源多元化，有本省毒株、国内吉林GZ18株和国外印度MP株，间接证明了当前疫苗不能很好地保护Orf的发生，将增加Orf的防控压力。Wang等[16]分析了2018年安徽省ORFV分离株F1L和B2L基因遗传特征，结果发现安徽省ORFV流行株是由山东和台湾南投流行株基因重组而形成的新毒株；Ahanger等[17]分析了克什米尔喜马拉雅地区ORFVB2L和VIR基遗传特征，结果显示当地流行的ORFV绵羊分离株与希腊和意大利的绵羊分离株具有高度同源性，而ORFV山羊分离毒株与中国的山羊分离株具有高度的同源性。以上研究者的结论与本研究相一致，ORFV今后流行的毒株将会是基因重组毒株为主。

针对 ORFV毒力相关基因的分析有利于解析不同ORFV 毒株间致病性的差异，而且相关毒力基因的发现可为ORFV 基因缺失苗的构建及弱毒疫苗的制备提供重要的理论依据。GIF是ORFV117基因编码产生，它是病毒感染后中晚期表达的免疫调节蛋白的毒力基因之一[12]。本研究中4份临床样品中ORFV的GIF基因均由798个核苷酸组成，编码265个氨基酸。4份临床样品中ORFVGIF基因核苷酸及其推导的氨基酸序列相似性分别为97.2%～99.6%和97.7%～99.6%；与国内（NP、YX、GO、SJ1、CL18、SY17、NA17、GZ18、OV-HN3/12 和NA1/11）株核苷酸及其推导的氨基酸序列的相似性分别为95.7%～99.0%和94.7%～99.2%；与国外（OV-SA00、0VIA82和MP）株核苷酸及其推导的氨基酸序列相似性分别为95.6%～98.0%和95.1%～98.9%；与德国D1701弱毒株核苷酸及其推导的氨基酸序列相似性分别为96.0%～96.4%和88.7%～89.4%，与NZ2参考株核苷酸及其推导的氨基酸序列相似性分别为95.9%～96.1%和95.1%～96.6%。遗传进化树结果显示4份临床样品中的ORFV毒株均在同一分支上，与广州（GZ18）株、吉林NA17株、福建（GO和YX）株、美国OV-SA00株和印度MP株处于同一进化分支上，亲缘关系较近；与吉林（CL18和SY17）株、广州（OV-HN3/12 和NA1/11）株、美国（OVIA82和TVL）株和新西兰NZ2参考株处于相邻分支上，与德国D1701弱毒株亲缘关系最远，处于不同进化分支上。

综上所述，本研究获得了4份临床样品中ORFVB2L、F1L和GIF基因序列并将序列上传至GenBank中，丰富了ORFV相关基因序列的数据库，阐明了福建省部分羊场当前ORFV的分子流行特征，为福建省今后有效防控Orf提供了理论依据。