不同基因型大豆苗期耐低磷性鉴定及指标筛选

王晶琴，石贵阳，杨松花，陈 竹，杨通黎，马秀国

（贵州大学农学院，贵州 贵阳 550025）

0 引言

【研究意义】大豆（Glycine maxL.）是食用油和植物蛋白的重要来源[1]，也是重要的保健食品和新型工业原料[2-3]。近年来，我国大豆在供需方面的矛盾日渐突出[4]，提高我国国内大豆的产量以保障正常的供给具有重要的现实意义[5]。磷在土壤中的生物有效性很低，缺磷是制约大豆增产的主要营养因素[6]。磷属于非可再生资源，全球的磷矿资源预计仅能利用50～100年[7]。而且施用的磷肥极易被土壤固定，不能有效解决作物缺磷问题[8-9]，过量施磷还增加了农业面源污染的风险。挖掘大豆自身活化和利用土壤磷库的潜力、选育磷高效品种对减少磷肥用量、保护生态环境、促进农业可持续发展具有重要意义。【前人研究进展】磷构成核酸、磷脂、ATP等重要有机分子，因此缺磷会降低细胞磷浓度，削弱能量的固定和释放，不利于养分和光合产物的吸收和转运，并进一步影响细胞分裂和植株生长，最终造成减产。对大豆、苦荞、紫花苜蓿等作物的研究表明，不同基因型的品种对磷的利用效率存在显著差异，从而为磷高效品种的筛选提供了材料。研究早期，主要选用生物量[10]、产量[11]、磷吸收量和磷利用效率[12]等单一指标来筛选磷高效大豆品种。但大豆磷效率是受多基因控制的复合数量性状[13]，大豆对磷的感知、截获、活化、吸收、转运和利用能力都会影响其磷效率，目前仍缺少统一的磷效率评价体系，难以准确鉴定磷高效利用大豆品种及其控制基因。近年来，结合耐性指数、主成分分析、隶属函数法和灰色关联分析的综合评价体系在作物抗逆和耐瘠性评价中得到广泛运用[14-18]。武兆云等[19]通过主成分分析将大豆耐低磷评价指标归纳为地上部生物量因子、磷因子和根系因子。栗振义等[20]利用综合评价体系发现，与耐低磷性最相关的指标有茎叶干重、株高、根干重和根长，可用于紫花苜蓿耐低磷性的评价筛选。杨春婷等[21]利用综合评价体系研究苦荞耐低磷性，认为根表面积、根长、株高、地上部干重等指标可作为苦荞苗期的耐低磷能力的快速鉴定指标。【本研究切入点】在低磷胁迫生态环境中寻找有潜力的个体或群体是收集磷高效种质的最有效方法。西南地区是典型的低磷环境，2019年农业农村部办公厅提出《大豆振兴计划实施方案》，将西南地区列为确保大豆增产的重点区域。目前，还缺乏西南地区磷高效大豆品种筛选相关研究。【拟解决的关键问题】本研究通过对西南地区5种不同大豆种质材料和北方地区5种不同大豆种质材料的19个指标进行主成分分析、隶属函数分析、聚类分析及灰色关联分析，构建耐低磷评价体系，并筛选出耐低磷性种质材料，为西南地区大豆耐低磷研究以及耐低磷品种的筛选、遗传改良和品种培育提供基础材料。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试大豆品种包括北方地区选育且能在贵州省成功繁育的大豆品种：汾豆62号（Fd62）、冀豆12号（JD12）、晋豆 23号（Jd23）、铁豆 40号（Td40）、铁丰31号（Tf31）；西南地区自主选育的大豆品种：矮选（Ax）、黔豆11号（Qd11）、黔豆7号（Qd7）、川豆 14（Cd14）、滇 86-4（Dd86-4）。

1.2 试验设计与植株培养

试验设正常供磷的对照处理（0.5 mmol·L-1，KH2PO4， NP）和 低 磷 胁 迫 处 理 （0.02 mmol·L-1，KH2PO4，LP），每个品种每个处理设6次生物学重复。挑选大小一致且饱满的大豆种子，1%次氯酸钠灭菌，无菌水浸种后，恒温避光培养。待子叶长出后，将幼苗移至1/2剂量营养液并逐步过渡到全量营养液[22]中培养至三叶展开后进行缺素处理，12 d后收获植株并测定相关性状。

1.3 耐低磷指标的测定

1.3.1 光合特征参数的测定 选取倒三叶，于上午9：00-11： 00采用LI-6400 XT型手持式光合仪测定净光合速率（Pn）、气孔导度（Gs）、胞间CO2浓度（Ci）和蒸腾速率（Tr）等光合特性参数。内置光源光强设为 550 μmol·m-2·s-1、CO2浓度为 430 μmol·mol-1，室温25 ℃。

1.3.2 光合色素含量的测定 采用乙醇浸提法，选取缺素处理12 d的大豆倒三叶，去除中脉后，测定叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量。

1.3.3 形态指标及生物量测定 株高用直尺测量；茎粗用游标卡尺测量；使用S-120便携式叶面积扫描仪测定叶面积；以子叶节为界，将植株分为茎叶和根系，分别称量根及茎叶鲜重；用根系扫描仪和WinRHIZO软件测定根长、根系平均直径、根体积、根表面积、根尖数。最后105 ℃杀青30 min，并在75 ℃下烘干至恒重，分别称量茎叶及根干重，并计算根冠比。

1.4 数据统计分析

1.4.1 各指标耐低磷系数（Low phosphorus tolerance coefficients，LPTC）[23]

式中，LPTC1为低磷处理下的指标测定值，LPTC2为正常供磷处理下的指标测定值。

1.4.2 不同大豆基因型各综合指标的隶属函数值[24]

式中，u(Xj)表示第j个综合指标的隶属函数值，Xj表示第j个综合指标值；Xmax表示第j个综合指标的最大值，Xmin表示第j个综合指标的最小值。

1.4.3 各综合指标的权重[24]

式中，wj表示第j个综合指标在所有综合指标中的重要程度及权重；pj为各品种第j个综合指标的贡献率。

1.4.4 各大豆品种的综合耐低磷能力的大小[24]

式中，D表示在低磷胁迫条件下各品种耐低磷能力的综合评价值。

1.4.5 灰色关联系数及灰色关联度[25]以各指标LPTC值（比较序列）和D值（参考序列）计算各指标间的关联系数ξi(k)及关联度(γi)。

数据整理及计算用WPS 2019表格，因子分析、相关性分析和主成分分析用SPSS20.0，聚类分析用Origin 2018。

2 结果与分析

2.1 各单项指标的耐低磷系数及其相关性分析

指标相对值能够消除品种间固有差异，较之绝对值更能准确反映植物耐低磷能力的大小[20]。根据公式（1）计算各测定指标的相对值，即耐低磷系数（LPTC）。由表1可知，低磷胁迫促进光合产物向大豆的地下部分配，根系干重和根冠比除黔豆11号外，其余品种均呈增加趋势。不同基因型之间，根系构型的变化方向不同：汾豆62号、冀豆12号和晋豆23号主要通过延伸根长并增加根尖数量来响应低磷环境；以铁丰31号、滇86-4、铁豆40号为代表的其余品种则通过扩大根系直径、增加根系与土壤接触的面积来获取更多的磷。值得注意的是，在低磷胁迫下，黔豆11号是唯一被检测到根冠比和根系干重下降的品种，但其根系表面积、根系直径升高，提示黔豆11号的根系获取更多的磷是不以消耗更多光合产物为代价的。

表1 不同基因型大豆苗期各单项指标的耐低磷系数Table 1 Low-phosphorus tolerance coefficients of soybean varieties at seedling stage

对光合特征参数的分析表明，低磷胁迫降低多数大豆基因型的光合速率、气孔导度和蒸腾速率，这不利于光合产物的累积，且削弱了养分向地上部的运输。因此低磷胁迫下养分和光合产物的供应减弱，而且植株将更多的养分和光合产物分配到地下部，使得地上部株高、茎粗和叶面积降低，最终导致地上部鲜重和干重下降。低磷胁迫总体提高叶绿素含量，但不同基因型之间类胡萝卜素的变化趋势不同。

通过地上地下形态、生物量以及生理生化指标间存在的相关性可表明各指标间是否存在依存关系及相关关系的方向与强度[26]。从单项指标的相关系数矩阵（表2）来看，各指标间的相关性导致信息冗余。如株高与地上部鲜重、地上部干重和根尖数存在相关性且差异极显著，与根体积、根表面积和蒸腾速率存在相关性且差异显著；地上部鲜重与地上部干重、根表面积和根体积存在显著或极显著相关；地下部鲜重与根长存在极显著相关性；地下部干重与根长存在显著相关性，与根冠比极显著相关。各单项指标在大豆耐低磷中所起的作用不尽相同，表明大豆耐低磷性是一个复杂的综合性状，直接利用各单项指标不能准确、直观地进行大豆耐低磷性评价。因此，为弥补单项指标耐低磷性评价的不足，需在此基础上进一步利用其他多元统计方法进行分析和评价。

表2 各单项指标耐低磷系数的相关系数矩阵Table 2 Correlation coefficient matrix of low-phosphorus tolerance coefficients on individual indices

2.2 主成分分析

将生理、形态以及根系等19个指标的耐低磷系数进行主成分分析，前5个综合评价指标CI1～CI5的特征值均大于1，且累积贡献率达 91.12%（表3）。因此将19个单项指标转换为5个新的相互独立的综合指标。第1主成分中，根体积、根平均直径、根尖数、根冠比、光合速率、胞间CO2浓度、气孔导度和蒸腾速率有较高载荷量；第2主成分中，叶面积及叶绿素含量具有较高载荷；第3主成分中，地下部鲜重、类胡萝卜素含量具有较高载荷；第 4 主成分中，地上部鲜重、地下部干重和根长具有较高载荷；第5主成分中，地上部干重和根表面积具有较高载荷。

表3 各综合指标主成分的特征向量及贡献率Table 3 Eigenvectors and contribution rates of principal components of individual comprehensive index

2.3 不同基因型大豆综合评价

2.3.1 隶属函数分析 根据公式（2）计算10个不同大豆基因型5个综合指标的隶属函数值u(Xj)（表4）。由表4可知：铁丰31号的隶属函数值最大[u(X1)=1]，表明此品种在CI1表现为耐低磷性最强，而晋豆23号隶属函数值最小[u(X1)=0]，表明此品种在这一综合指标上表现为耐低磷性最差。

2.3.2 权重确定 根据公式（3）计算各综合指标的权重。经计算，得到5个综合指标的权重分别为0.394、0.274、0.156、0.104 和 0.072（表4）。

2.3.3 综合评价 根据公式（4）计算大豆耐低磷评价值（D值），并根据 D 值对其耐低磷性进行强弱排序（表4）。耐低磷大小排序为：铁丰31号＞滇86-4＞铁豆40号＞冀豆12号＞黔豆11号＞黔豆7号＞川豆14＞晋豆23号＞矮选＞汾豆62号。根据D值大小用最大距离法进行聚类分析（图1），可将10个基因型大豆划分为3类：铁丰31号和滇86-4为第Ⅰ类，属耐低磷型；黔豆11号、铁豆40号和冀豆12号为第Ⅱ类，属中度耐低磷型；黔豆7 号、川豆14、晋豆23号、矮选和汾豆62号为第Ⅲ类，属弱耐低磷型。

表4 各基因型大豆的综合指标值、权重、u( Xj)值及综合评价(D)Table 4 Comprehensive index, index weight, u( Xj), and comprehensive evaluation value (D) of soybean cultivars

2.4 灰色关联分析

本研究通过灰色关联分析法，对各形态以及生理生化等19个指标进行综合评价，旨在揭示比较序列（LPTC值）与参考序列（D值）的关联关系，从而评价各指标在耐低磷特性评定中的作用强弱。各指标LPTC值与D值间的关联度大小依次为地上部鲜重＞蒸腾速率＞地上部干重＞气孔导度＞叶面积＞株高＞茎粗＞根体积＞胞间CO2浓度＞根平均直径＞类胡萝卜素含量＞光合速率＞根长＞根尖数＞根表面积＞叶绿素含量＞地下部鲜重＞地下部干重＞根冠比（表5）。

表5 各指标与耐低磷系数的关联度及位次Table 5 Correlation and rank on low-phosphorus tolerance coefficients of individual indices

3 讨论

缺磷限制了43%的陆地生产力[27]。西南地区土壤全磷和有效磷含量低，供磷能力弱[28]。而苗期根系弱小，极大地限制了磷的获取，因此苗期是西南地区大豆需磷的临界期，也是评价大豆耐低磷能力的关键期[29-30]。室内试验营养液水培法不仅可以消除土壤异质性带来的影响，还能提高试验的重复性，一般将 0.5 mmol·L-1KH2PO4作为大豆[31-32]正常磷水平。本研究以0.5 mmol·L-1KH2PO4作为大豆的正常供磷水平，以0.02 mmol·L-1的KH2PO4作为低磷胁迫处理来筛选耐低磷大豆。由于KH2PO4是易溶性磷，而且培养过程中持续通气增加了溶液的均匀性，因此水培能准确鉴定大豆对磷的吸收和利用能力。

为了克服土壤供磷不足，植物进化出了一系列适应机制来维持磷稳态。其中，改变自身形态结构，提高根系吸收磷的能力是主要机制之一。磷高效基因型主要表现出侧根数量、根系平均直径、根体积和根系质量呈增加趋势[33]，但不同磷效率基因型之间存在显著差异[34]。低磷胁迫会抑制叶片光合作用的暗反应，减少光合产物的累积。由于光合产物的合成及向地下部转运的效率不同，导致低磷胁迫时不同基因型地上部生物量表现出极大的差异。低磷胁迫使植物地上部生物量[35]和叶面积[36]等降低；根冠比[37]、根系表面积[38]、总根长[39]等增加；使光合速率、气孔导度与蒸腾速率等光合指标下降[40-41]。本研究结果表明，低磷胁迫下大多数大豆品种的株高、茎粗和叶面积降低；地上部干鲜重降低，地下部干鲜重升高；根冠比除黔豆11号外，其余均增加；根长和根表面积也增加；光合速率、气孔导度和蒸腾速率降低等。研究结果与前人的结果类似。目前已有相关文章报道了大豆耐低磷品种的筛选与评价[42-44]，但还未有关于西南地区耐低磷大豆的评价体系。本研究先将各指标转化为耐低磷系数，消除遗传学差异，之后用主成分分析、隶属函数、聚类分析和灰色关联分析等方法综合筛选耐低磷大豆及指标，进而建立了能快速筛选西南地区耐低磷大豆的评价体系。

性状指标的合理选择是作物耐低磷性鉴定的关键，但关于植物耐低磷鉴定的指标选择还没有统一的定论[45]。目前，地上部干重、株高、茎粗、根长、根冠比、根表面积、根系直径、叶绿素含量、光合指标等都可作为筛选磷高效基因型的指标[46-49]。本研究将19个指标的耐低磷系数（比较数列）和综合评价D值（参照数列）作为一个整体，进行灰色关联度分析。结果显示，与D值关系最为密切的指标依次为地上部鲜重、蒸腾速率、地上部干重、气孔导度、叶面积、株高、茎粗和根体积，包含了生物量、形态指标以及生理指标。这表明作物低磷耐性体现在外部形态的建成和内部生理生化的变化上。因此在大豆苗期耐低磷性鉴定中，要有针对性地选取与D值密切相关的指标，尤其是像蒸腾速率以及气孔导度光合参数指标和相关地上以及根系形态指标，这样既能使鉴定的结果具有可靠性也能节约时间与成本。

根据D值进行聚类分析将10种不同基因型大豆划分成3大类：耐低磷型、中间型、弱耐低磷型，其中：铁丰31号和滇86-4为耐低磷品种，两个品种的地上部鲜重和干重、叶面积、根表面积和根体积的耐低磷系数较高，表明铁丰31号和滇86-4具有很强的磷吸收和利用效率，可作为大豆耐低磷育种及耐低磷机理研究材料。铁豆40号、冀豆12号和黔豆11号为中度耐低磷品种，3个品种的地上部干重耐低磷系数为0.842～0.904，根系表面积为耐低磷系数0.925～1.16，次于铁丰31号和滇86-4，是中等耐低磷品种；黔豆7 号、川豆14、晋豆23号、矮选和汾豆62号为弱耐低磷品种，其中晋豆23号的划分和刘渊等[43]的研究结果一致，其他几个品种暂未发现进行耐低磷筛选的相关研究。刘灵等[50]的研究表明，大豆的耐低磷能力与其生长区域土壤有效磷显著相关，西南地区土壤严重缺磷，而且由于气候多变，生物多样性高，因此西南地区可能蕴藏着大量的磷高效大豆种质资源。另一方面，不同基因型耐低磷的策略也存在差异，比如黔豆11号通过提高根系表面积来吸收更多的磷，而增加根系长度是冀豆12号的主要耐低磷策略。在下一步研究中，应结合盆栽试验，鉴定各品种对磷的活化及通过与微生物共生获取磷的能力，完善大豆耐低磷评价体系。

4 结论

低磷胁迫对不同基因型大豆苗期各指标均有显著影响。苗期耐低磷性强的大豆品种有铁丰31号、滇86-4、黔豆11号、铁豆40号等，可作为大豆耐低磷育种及耐低磷机理研究材料。地上部鲜重、蒸腾速率、地上部干重、气孔导度、叶面积、株高、茎粗和根体积可作为评价大豆苗期耐低磷性的指标。