优质、抗病、耐储藏香稻新品种福香占的选育与应用

吴方喜，罗翠琴，王颖姮，谢云杰，罗 曦，朱永生，谢鸿光，蒋家焕，蔡秋华，谢华安，张建福

[1.福建省农业科学院水稻研究所，福建 福州 350019；2.闽台作物有害生物生态防控国家重点实验室/水稻国家工程研究中心/农业农村部华南杂交水稻种质创新与分子育种重点实验室/福州（国家）水稻改良分中心/杂交水稻国家重点实验室华南研究基地/福建省作物种质创新与分子育种国家重点实验室培育基地/福建省作物分子育种工程实验室/福建省水稻分子育种重点实验室，福建 福州 350003]

0 引言

【研究意义】水稻是我国最主要的粮食作物之一，三分之二以上的人口以稻米为主粮。2019年，我国大米总消费量达到1.93亿t，其中食用大米消费量是1.588 0亿t[1]，占三大食用粮大米、小麦和玉米总消费的59.4%。随着我国经济社会的发展，人民生活水平的提高，人民对稻米的品质要求越来越高。稻米不仅仅要求要好吃，还要有香味。因此，为了满足优质稻米市场的需求，选育高档优质香稻是水稻新品种选育的一个重要方向。【前人研究进展】2010年以前，在生产上应用面积较大的优质常规籼稻主要有广东系列优质稻和湖南系列优质稻。广东系列优质稻如粤晶丝苗2号[2]等品种米质好、抗稻瘟病，但是粒型不够细长，多数不具有香味或香味比较淡。湖南系列优质稻如玉针香[3]、湘晚籼17号[4]等品种具有优质和香味，但是，这些品种的稻瘟病抗性不好，不适合在福建种植。近年来，科研人员利用分子标记等技术选育了抗病兼具香味的水稻新品种[5-6]，但未见新品种耐储性的研究。【本研究切入点】迄今鲜见涉及优质、抗病、耐储兼具香味的常规稻新品种选育研究报道。【拟解决的关键问题】本团队于2010年确立了选育优质、抗稻瘟病、耐储藏香稻作为水稻育种的一个方向。在亲本材料选择上，选用来源于广东农业科学院水稻研究所的常规稻粤晶丝苗2号作为母本，它具有株叶形态好、高抗稻瘟病、口感好、较耐储藏的优点，但是粒型不够细长，香味比较淡；选用从湖南省水稻研究所引进的中间材料H603作为父本，它具有粒形长、有香味、米质优良的优点，但不抗稻瘟病、不耐储藏。期望通过杂交重组，综合双亲的性状，选育出粒形细长、米质优良、抗稻瘟病、耐储藏香稻新品种。

1 材料与方法

1.1 试验材料

所用材料粤晶丝苗2号来源于广东省农业科学院水稻研究所，系优质常规稻；H603来源于湖南省水稻研究所，系优质常规香稻。

1.2 福香占的选育

2011年春季在海南省三亚市福建省南繁育种基地用粤晶丝苗2号（广东优质常规稻）与H603（湖南优质常规香稻中间材料）杂交，后代通过系谱法选择株叶形态好、粗秆大穗、成熟期叶片转色好的单株，并在福建省沙县等地进行稻瘟病抗性鉴定，结合室内耐储藏和米质鉴定，淘汰感病、不耐储藏和米质差的株系，对所获得的优良单株连续多年在福建省沙县、龙岩和海南省三亚市反复加代。2015年晚季，编号为M08单珠表现株叶形态较好、粗秆大穗、成熟期叶片转色好，定名为福香占（图1）。

1.3 福香占香味基因扩增

根据文献报道[7]的引物进行Badh2/badh2序列的扩增。叶片DNA提取采用CTAB法，用Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase（Vazyme）按照试剂说明书进行PCR扩增，扩增产物经过电泳，切胶回收后送尚亚生物进行测序，序列拼接和比对用DNAMAN软件完成。

1.4 福香占稻瘟病抗性鉴定

将福香占和明恢63水稻种子播种于温室大棚接种池中，培养至三叶一心备用。播种的同时将采自福建稻区的10个稻瘟病菌生理小种JL8053-2、JL1501-1、JY18058-1、 JY18028-4、 NH18046-2、 NH18048-3、SH17010-3、 SH18067-6、 SH17011-7、 SM17020-1 于26 ℃培养箱中倒置暗培养6 d进行活化，转接至米糠培养基中，相同条件下培养5 d；至菌丝长满2/3培养皿，将菌丝轻轻刮净于光照培养箱进行产孢3～5 d。孢子含量调整至1.5×105个·mL-1，加入0.02%的TWEEN-20完成孢子悬浮液的制备。通过微型空气压缩机将孢子悬浮液均匀喷洒于叶片表面，7 d后按国际水稻研究所稻瘟病抗性评价分级标准调查发病级别，按全国稻瘟病菌生理小种联合试验组制定的标准进行抗感评定。

1.5 福香占稻瘟病抗性基因分析

1.5.1 基因芯片检测 提取福香占水稻叶片DNA，将DNA进行质量分析、稀释、变性、全基因组扩增、DNA片段化、纯化、重悬，再一次变性后与芯片杂交，进行单碱基延伸、染色，利用iScan扫描仪进行芯片扫描，最后通过genome studio软件对扫描生成的原始数据进行判断及分型。

1.5.2 福香占稻瘟病抗性基因扩增 以NCBI中Pia、Pita基因为参考序列，Primer Premier 5 软件设计引物，利用Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase（Vazyme） 进行扩增，由于Pia和Pita基因编码区无法整段序列扩增，所以分成两段扩增[8-9]。测序结果通过DNAMAN软件进行比对。扩增体系及程序见表1～2。

表1 PCR扩增引物设计Table 1 Design of primers for PCR amplification

1.6 福香占耐储藏特性分析

2018年，收获福建省农业科学院水稻研究所沙县夏茂基地种植的福香占、航2号和福恢7 185种子，风干后，在40 ℃烘箱干燥2 d以平衡水分和破除休眠。各数100粒饱满种子放在小网袋中，挂在恒温恒湿箱（Binder，德国）中人工加速老化处理，处理条件为温度：40 ℃，湿度：80%。在0、7、14、21 、28、35、42 d等7个时间段，每天上午9：00，分别取样进行发芽率测定。在各个时间点取样后立即将种子放置于2层滤纸培养皿，清水培养，温度为28 ℃，相对湿度70%，光照黑暗交替14 h/10 h培养室中培养。设3个生物学重复。10 d后统计种子发芽率。采用Microsoft Excel 2010进行数据整理，计算标准误（SD），显著性分析使用软件DPS，作图使用SigmaPlot 10.0。

表2 PCR扩增体系和反应条件Table 2 PCR amplification system and reaction conditions

2 结果与分析

2.1 福香占的主要农艺性状和产量表现

2.1.1 福香占的主要农艺性状 福香占主要农艺性状两年区试平均表现：群体整齐，株型适中，熟期转色好、每亩有效穗数14.8万，株高116.3 cm，穗长25.1 cm，每穗总粒数196.0粒，结实率81.9%，千粒重25.1 g。

2.1.2 福香占区试产量表现 2018年初试，平均产量7 897.5 kg·hm-2，比对照II优3301减产13.9%，达极显著水平；2019年续试，平均产量7 662.0 kg·hm-2，比对照II优3301减产19.2%，达极显著水平。两年区试平均产量7 780.5 kg·hm-2，比对照II优3301减产16.5%（表3）。2019年生产试验平均产量7 209.0 kg·hm-2，比对照II优3301减产7.4 %（表4）。

表3 2018-2019年福香占区域试验产量Table 3 Yield of Fuxiangzhan at 2018-2019 regional trials in Fujian

表4 2019年福香占生产试验产量Table 4 Yield of Fuxiangzhan at 2019 production trial in Fujian

2.2 福香占的稻米品质

据农业农村部稻米及制品质量监督检测试验中心报告，糙米率79.9%，整精米率59.8%，垩白度0.1%，透明度1级，碱消值7.0级，胶稠度72 mm，直链淀粉含量15.6%，米质达部颁二等优质食用稻品种品质标准。福香占分别于2018、2019年在福建省优质稻食味品质鉴评中获银奖、金奖。2020年参加第三届全国优质稻品种食味品质鉴评获得金奖。

2.3 福香占的香味基因分析

Badh2基因有15个外显子和14个内含子（图2），起始密码子位于外显子1，终止密码子位于外显子15。从福香占中扩增Badh2/badh2基因序列，将获得的序列进行拼接，进而与数据库中日本晴（Nipponbare）中该基因序列进行比对。比对结果表明，福香占在第七外显子处有8 bp碱基缺失（5＇-GATTATGGC）和3个单核苷酸多态性（SNPs）（图2）。与香稻苏玉糯、Basmati385、Basmati370等品种突变位点一致，为badh2-E7位点突变[5]。

2.4 福香占的稻瘟病抗性基因分析

2.4.1 福香占的田间稻瘟病抗性表现 2018年福香占参加福建省中稻区试，稻瘟病田间抗性鉴定表现抗叶稻瘟（R）和抗穗颈瘟（R），苗期室内人工接菌（采自福建省不同稻瘟病区的菌株3～4种混合）鉴定表现抗稻瘟病（R）。2019年福香占继续参加福建省中稻续试，田间鉴定表现抗叶稻瘟（R）和中抗穗颈瘟（MR），苗期室内人工接菌（采自福建省不同稻瘟病区的菌株3～4种混合）鉴定表现为抗稻瘟病（R）；福香占两年稻瘟病抗性鉴定综合评价为中抗稻瘟病（R）（表5）。

表5 福香占对稻瘟病的抗性鉴定结果Table 5 Certified blast-resistance of Fuxiangzhan

2.4.2 福香占室内稻瘟病抗性鉴定 采用喷雾接种稻瘟病菌的方法，分别对福香占和对照明恢63接种10个采自福建省不同地区的稻瘟病菌生理小种。鉴定结果表明，福香占对其中8个菌株表现为抗病，对2个菌株表现为中抗；明恢63对其中的1个菌株表现为中抗，对其余9个菌株均表现为感病（图3、表6）。

表6 福香占和明恢63的抗性鉴定Table 6 Blast-resistance of Fuxiangzhan and Minghui 63

2.4.3 福香占稻瘟病抗性基因分析 结合GSR40K水稻高密度全基因组SNP芯片对福香占中可能的稻瘟病抗性功能基因进行分析，结果表明福香占中可能含Pia、Pi2、Pita和Pib等4个已克隆的稻瘟病抗性基因。以NCBI数据库中Pia、Pi2、Pita、Pib的基因序列作为参考序列，根据同源克隆的方法分别扩增福香占中Pia、Pi2、Pita和Pib这4个R基因的编码区。测序对比结果表明福香占中的Pi2和Pib编码区和响应的氨基酸序列与NCBI中的参考序列相同；而福香占中的Pita和Pia编码区序列与NCBI数据库中的参考序列各有4个碱基的差异，分别造成了3个和4个氨基酸的差异，分别命名为PitaFXZ和PiaFXZ（图4）。

2.5 福香占的耐储藏特性分析

收获后的福香占、航2号、福恢7185种子风干后置于42 ℃烘箱干燥2 d以平衡水分和破除休眠，室温下自然老化（CK）和人工老化（温度40 ℃，湿度80%）不同阶段进行发芽率比较（图5A）。3个品种起始发芽率一致，3个品种自然老化0～42 d发芽率差异不显著（P＜0.05）。人工老化7 d和14 d，3个品种发芽率无显著变化（图5B-C），至21 d，人工老化处理的3个品种分别发生不同程度的发芽率下降，航2号下降最多，发芽率为77.83%，福恢7185发芽率最高为88.94%，福香占居中，发芽率为83.00%；至28 d，航2号和福恢7185发芽率下降到分别为57.00和56.67%，福香占发芽率为77.67%；至35 d，航2号发芽率仅有18.00%，福恢7185发芽率35.56%，福香占为74.33%；至42 d，航2号已经基本不发芽（3.67%），福恢7185发芽率仅12.33%，而福香占发芽率仍然高达61.67%（图5B-C）。上述结果表明，在人工老化后第28天开始，对照航2号和福恢7185种子活力急剧下降，而福香占仍然具有较强的种子活力，耐储藏性较好。

3 讨论

3.1 福香占的优质性

随着人民生活水平的提高，人民不仅要求吃饱，还要求吃好，长粒香型高档优质米更受欢迎。根据此目标，我们选择了无香味、小粒型、综合性状好的粤晶丝苗2号和有香味、长粒型高档优质稻中间材料H603作为双亲，期望选育出长粒香型高档优质稻。粤晶丝苗2号是广东省农业科学院水稻研究所于2006年育成的优质常规稻，并通过广东省品种审定委员会审定[7]。该品种在广东早季米质达国标和省标优质2级，整精米率63.6%，垩白粒率4%，垩白度0.2%，长宽比3.4，千粒重21.2 g，直链淀粉16.1%，胶稠度74.2 mm。来自湖南的H603粒形长且千粒重大，有香味，米质优良。通过杂交选育的福香占综合了双亲的优质性。福香占米质化验结果：整精米率59.8%，垩白度0.1%，透明度1级，碱消值7.0级，胶稠度72 mm，直链淀粉含量15.6%。福香占粒长达到7.4 mm，长宽比3.8，属于细长粒型。福香占千粒重25.1 g，比粤晶丝苗2号大18.4%。该品种分别于2018、2019年在福建省优质稻活动中获得银奖、金奖，于2020年获得第三届全国优质稻品种食味品质鉴评籼稻组金奖。因此，福香占在优质方面达到了选育出长粒香型高档优质稻的预期目标。

3.2 福香占的抗稻瘟病性

福香占对稻瘟病的抗性主要来源于粤晶丝苗2号。粤晶丝苗2号在2004-2005年广东区域中表现高抗稻瘟病，中B、中C群和总抗性频率分别为97.37%、94.12%、96.43%，病圃鉴定穗瘟1级，叶瘟1级。何秀英对粤晶丝苗2号的研究表明，粤晶丝苗2号除了含有位于2、6和12号染色体上的Pib、Pi2/Pi9和Pita/Pita-2的3个已知抗病基因，还有位于8号染色体的新隐性抗病基因pi55（t）[10]。福香占在两年福建省区试中表现高抗叶瘟和中抗穗瘟；福建省农业科学院植物保护研究所在苗期室内接种表明，对10个采自福建省不同地区的稻瘟病菌生理小种中8个具有抗性，抗谱率达到80%。通过基因芯片分析表明，福香占中可能含Pia、Pi2、Pita和Pib等4个已克隆的稻瘟病抗性基因。测序结果表明，Pi2和Pib基因与NCBI中的参考序列完全相同；而Pita和Pia在编码区与NCBI数据库中的参考序列各有4个碱基的差异，分别造成了3个和4个氨基酸的差异，分别命名为PitaFXZ和PiaFXZ。因此，福香占遗传了粤晶丝苗2号的稻瘟病抗性。

3.3 福香占的耐储藏性

福香占的耐储藏性主要来源于粤晶丝苗2号。在选育福香占之前，通过耐储藏性鉴定发现，粤晶丝苗2号在人工老化35 d的发芽率仍在50%以上，耐储藏性比较好。我们在粤晶丝苗2号和H603杂交后，通过对后代的每一代进行耐储藏鉴定，每世代淘汰不耐储藏的材料。因此，选育的福香占耐储藏性比较强。通过人工老化试验表明，福香占在人工老化35 d的条件下，发芽率为74.33%；在人工老化42 d的条件下，福香占发芽率仍然高达61.67%。

4 结论

福香占在2018-2019年福建省中稻区试、续试和生产试验表现较好，福香占米质达部颁二等优质食用稻品种品质标准，中抗稻瘟病，较耐储藏，具有香味，属于高档香型优质稻，适宜在福建作中稻种植。