IVIM-MRI在评估透明细胞肾细胞癌病理分级中的价值

康钦钦，边云，田冰，李晶，刘芳，郝强，陆建平

透明细胞肾细胞癌(clear cell renal cell carcinoma,CCRCC)占所有肾细胞癌亚型的近90%，是预后最差、转移潜能最高的一种亚型。WHO-ISUP病理分级系统是CCRCC患者独立的预后预测因素之一[1-3]。术前肾肿瘤穿刺活检术对病理分级的诊断符合率仅46%～64%[4-6]。对于老年人和偶然发现的局限于肾脏的小肿瘤，积极主动监测治疗方式在临床越来越受到推荐[7,8]，故寻找一种能够术前预测肿瘤病理分级的影像学方法有助于指导临床的治疗计划和预后评估。体素内不相干运动扩散加权成像(intra voxel incoherent motion diffusion weighted imaging,IVIM-DWI)所获得的表观扩散系数(apparent diffusion coefficient,ADC)值不仅能反映水分子的随机扩散运动，还可体现毛细血管网内的微循环灌注情况[9-11]。本研究通过比较IVIM-DWI相关参数在不同病理分级CCRCC中的差异，并且寻找这些参数与肿瘤微血管密度(microvascular density,MVD)的相关性，旨在评估IVIM-DWI术前预测CCRCC病理分级的价值。

材料与方法

1.病例资料

本研究为前瞻性研究，全部病例均经手术切除及病理证实。对2013年1月-2019年12月间行超声或CT平扫检查怀疑肾占位拟行肾脏切除术的133例患者行IVIM-DWI检查，此阶段患者的纳入标准如下:①原发性肾占位性病变且未接受过任何治疗；②MRI检查后1个月内行肾脏手术治疗；③所有受检者均无对比剂过敏病史、肝肾功能不全、肾脏血管性病变或其他泌尿系相关疾病。133例患者中包括109例透明细胞肾细胞癌和24例非透明细胞肾细胞癌。初始队列研究的排除标准如下：①术前扫描发现肺、骨或淋巴结转移者；②组织病理学分级不明(病理分级为Ⅱ-Ⅲ级、Ⅰ-Ⅱ分级或Ⅲ-Ⅳ级)；③图像质量不佳；④免疫组化的肿瘤组织样本不足。在109例CCRCC患者的初始队列研究中，有27例患者因上述排除标准被排除在外。最终的研究队列包括82例CCRCC患者，患者的平均年龄为52.2岁(范围26～79岁)，其中男62例，平均年龄51.8岁(范围26～76岁)，女20例，平均年龄54.7岁(范围36～79岁)。根据WHO-ISUP分级结果将患者分为4组，分别为ISUPⅠ级组(n=14)、ISUP Ⅱ级组(n=47)、ISUP Ⅲ级组(n=15)、ISUP Ⅳ级组(n=6)。由于各级肿瘤样本量较小，笔者采用Scelo等[12]推荐的方法，采用合并法将分级分为两组，分别为高级别组(Ⅰ级和Ⅱ级，n=61)和低级别组(Ⅲ级和Ⅳ级，n=21)。本研究经医院伦理委员会批准，所有患者均签署知情同意书。

2.检查方法

MRI检查采用3.0T超导型磁共振仪(Signa HDXt,GE Healthcare,USA)。嵌入式体部线圈用于信号的激发，8通道体部专用相控阵线圈用于信号的接收。受检者检查前禁食6 h，取仰卧位，将8通道体部专用相控阵表面线圈置于受检者腹壁前方，使其中心与脐和剑突连线的中点相一致，对受检者进行呼吸训练以减少呼吸运动伪影。

扫描序列及扫描参数: ①轴面抑脂FSE T2WI，TR 6316 ms，TE 72 ms，视野360 mm×360 mm～400 mm×400 mm，矩阵320×192，层厚5 mm，层间距1 mm，翻转角90°，NEX 2，带宽83.3 KHz。②自由呼吸触发肾脏SS-EPI DWI，TR 6000 ms，TE 58.6 ms，视野360 mm×360 mm～400 mm×400 mm，矩阵130×96，层厚5 mm，层间距1 mm，翻转角90°，NEX 8，带宽250 KHz，设定9个b值分别为0、20、50、100、200、400、600、800、1000 s/mm2。

3.图像处理与数据采集

本研究采用IVIM双指数模型来计算灌注分数f、伪扩散系数D*和单纯扩散系数D。双指数模型不仅可反映组织内水分子的扩散运动，还能体现组织的微血管灌注情况，随着b值的增大，IVIM-DWI 图像上组织信号的衰减会受到上述这两种因素的影响。双指数模型的计算公式为：S/S0=(1-f)exp(-b·D*)+f exp(-b·D)，其中S 为不同b值(b>0)IVIM-DWI图像的信号强度，S0表示b值=0时IVIM-DWI图像的信号强度，f为灌注分数，代表局部微血管灌注情况所致的扩散占全部扩散效应的百分比。D代表单纯扩散系数，反映局部组织水分子的真实扩散情况，单位为mm2/s。D*代表假性扩散系数，主要反映局部组织内与微血管灌注相关的扩散情况，单位为mm2/s[13]。

将所有患者的图像信息上传至GE ADW 4.4工作站，采用其自带的后处理软件进行图像处理分析。由两位具有5～10年MRI图像阅片经验的影像科医生在不知病理分级的情况下进行图像分析并取得一致意见，在获得的后处理图像上测量灌注分数(f)、假性扩散系数(D*)及单纯扩散系数(D)值。感兴趣区(region of interest,ROI)尽可能多的包括肿瘤的实性部分，尽量避开脂肪、囊变、出血坏死区域。为减少部分容积效应的影响，尽量将ROI靠近肿块的中心位置。当肿瘤实体部分信号不均匀时，在2～3个不同的信号区域勾画肿瘤实质的ROI，并计算以上参数的平均值，ROI面积为0.25～0.50 cm2。

4.标本的采集、处理及免疫组化染色

采用4%的中性甲醛固定溶液对标本处理后进行石蜡包埋，切片厚度为4 μm，首先进行常规H-E染色，采用WHO-ISUP核分级系统进行病理分级。分级应遵循最高原则，即当组织内肿瘤的核分级出现异质性时，应以最高分级为准，然后采用Envision法进行CD34免疫组化染色[14]。

根据Weidner等[15]报道的方法进行MVD的测量，即首先在低倍镜视野内(×100)选取组织内MVD最高的区域，然后转到高倍镜视野(×400)计算5个视野的微血管数目，取平均值作为微血管密度的测量值。微血管的判断标准：高倍镜下与背景完全不同的棕色或褐色的内皮细胞或内皮细胞丛均作为1个血管，另外只要结构不连，分支血管也可作为1个血管计数。

5.统计学分析

利用SPSS 20.0软件进行统计学分析。计量资料以均数±标准差表示，采用Mann-WhitneyU检验比较低、高级别组间肿瘤IVIM-DWI参数的差异。采用受试者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲线评估各参数值在鉴别诊断高级别与低级别组CCRCC中的效能并确定诊断阈值。低级别和高级别组CCRCC的MVD与IVIM-DWI各参数的相关性以及IVIM-DWI各参数与病理分级之间的相关性通过Spearman等级相关进行分析。以P<0.05为差异具有统计学意义。

结 果

不同病理分级CCRCC的IVIM相关参数值及MVD测量值见表1。高级别与低级别组CCRCC的D*值分别为(51.1±7.6)、(44.3±9.5)mm2/s，D值分别为(1.2±0.3)、(1.3±0.3)mm2/s，MVD测量值分别为(81.5±8.8)、(67.5±12.8)，差异均有统计学意义(P值均<0.05)。灌注分数(f)在两组间差异无统计学意义(P>0.05，图1)。

图1 CCRCC患者，女，65岁，WHO-ISUP Ⅲ级，体检发现左肾上极占位1周，近几日肉眼血尿间歇出现，时轻时重。a)T2WI图像；b)增强扫描实质期图像；c)单b值DWI图像；d)IVIM-D*图像，相应的D*值为42.35mm2/s；e)D图，相应的D值为1.23mm2/s；f)f图，相应的f值为41.75%。

表1 不同CCRCC的IVIM-DWI各参数值及MVD值比较

IVIM-DWI参数、ISUP分级及MVD的相关性分析结果见表2。D*、D及MVD值均与透明细胞癌的病理分级相关，其中D*值与病理分级呈正相关(r=0.346，P<0.05)，D值与病理分级呈负相关(r=-0.315，P<0.05)。MVD值与病理分级呈显著正相关(r=0.617，P<0.05)。灌注分数与透明细胞癌的病理分级无明显相关性。D*值及D值均与MVD存在相关性，其中D*值与MVD呈显著正相关(r=0.585,P<0.05)，而D值与MVD呈负相关(r=-0.337,P<0.05，图2～5)。

表2 IVIM-DWI参数、ISUP分级、MVD之间的相关性分析

ROC曲线分析结果显示，D值、D*值鉴别高、低级别CCRCC的ROC曲线下面积均为0.7(图6)。D值、D*值的诊断阈值分别为1.2 mm2/s、44.4 mm2/s，敏感度分别为70.0%、60.7%，特异度分别为70%、90%。

图6 a)D值鉴别诊断高、低级别CCRCC的ROC曲线；b)D*值鉴别诊断高、低级别CCRCC的ROC曲线。

讨 论

本研究首先对82例CCRCC患者进行IVIM-DWI研究，获得了能够反映肿瘤组织水分子扩散情况的参数即单纯扩散系数(D)、肿瘤组织内微循环血管灌注情况所导致的水分子扩散参数即假性扩散系数(D*)以及反映肿瘤组织内微血管血流灌注情况的参数即灌注分数(f)；然后对上述82例CCRCC患者的病理切片进行CD34免疫组化分析以量化肿瘤组织内MVD，以评估IVIM-DWI所获得的相关参数与不同级别透明细胞癌MVD的相关性。本研究结果显示D*及D值在不同病理分级CCRCC中差异有统计学意义，且两者均与WHO-ISUP分级有一定相关性。通过免疫组化分析，本研究发现不同病理分级透明细胞癌的MVD差异有统计学意义，且与D*值呈明显正相关，与D值呈负相关，与f值无明显相关性。

D、D*值与病理分级：本研究结果显示，D*值在不同病理分级CCRCC中存在统计学差异，且与CCRCC分级呈正相关(P<0.05)。以往诸多研究报道D、D*值均与细胞密度相关，细胞密度越大，D和D*值越小[16,17]。然而，另有研究报道ADC值与细胞密度无明显相关性[18]。本研究结果显示，不同病理分级CCRCC之间有明显的D和D*值差异，高级别CCRCC的D*值较低级别CCRCC高，而D值较低级别CCRCC略低。笔者分析其原因可能是肿瘤的病理分级越高，血供越丰富，血流微循环所致的D*值越大，但高分级肿瘤组织的细胞粘度或细胞膜的屏障作用加强，从而使得组织内水分子的扩散运动受限，故D值减低[19,20]。本研究结果显示，D和D*值鉴别诊断高级别与低级别CCRCC的最佳阈值分别为1.2 mm2/s和44.4 mm2/s，诊断敏感度分别为70%、60%，特异度分别为90%、70%。

灌注分数与病理分级：本研究结果显示，f值与CCRCC的病理分级无明显相关性(相关系数r=-0.071,P=0.526)。但也有研究发现f值与CCRCC分级呈明显相关性，这可能是由于高级别透明细胞癌血供更丰富，血容量较低级别透明细胞癌增加的缘故[21]。由于90%以上的肾脏血容量存在于肾脏皮质内，肾皮质的平均灌注分数(f)值明显高于肾髓质[22]。本研究得出两者无相关性结论的原因可能与高级别CCRCC的患者数量较少有关，未来还需要加大样本量行进一步研究。

D、D*值与MVD：相关研究分析了基于单指数模型DWI所获得的ADC值与肿瘤组织内MVD之间的关系[23]，但其所使用的单指数模型只能反映水分子的总体扩散情况，并不能将血流灌注情况所导致的水分子扩散运动的差异表现出来。而根据Huuse等[23]研究的双指数模型，可以更好地描述组织中信号的衰减程度与不断增加的b值之间的关系，并且能分别得到单纯反映水分子组织扩散率的参数和反映组织微循环灌注情况的定量IVIM参数。本研究结果显示，D*和D值均与肿瘤组织的MVD显著相关。此外，尽管恶性肿瘤的生物学行为类似，但相关研究发现D*值和f值在不同器官组织肿瘤间存在明显差异[24]，笔者推测这种差异是由于血管灌注情况不同所导致的；本研究结果也证实了这一点，MVD与D*值显著相关，D*值代表组织内毛细血管的微循环灌注情况，表明MVD与肿瘤的血流灌注密切相关。

灌注分数与MVD：本研究结果表明灌注分数(f)值与MVD值无明显相关性，反映了肿瘤组织的血容量与其微血管密度无明显相关性，肿瘤组织体积较大时，其微血管密度减低，但其血容量可能并不会低于低级别肿瘤。此外，在不同的组织器官恶性肿瘤中，D值的差异性并不明显，这可能从侧面印证了恶性肿瘤的单纯水分子扩散特征可能是相似的。

MVD与组织病理学分级：肿瘤的组织病理学分级目前是CCRCC预后模型中唯一的一种基于组织学的预后指标[25]。MVD可简单量化肿瘤组织的血管生成能力，CCRCC的血供非常丰富，故肿瘤的MVD为透明细胞癌比较标志性的免疫组化指标。MVD也是CCRCC不同病理分级的独立预测指标。既往研究表明，不同病理分级透明细胞癌CT增强模式的差异是由血管生成能力所导致，与肿瘤组织的MVD密切相关[26]。本研究结果显示，肿瘤组织的MVD与病理Fuhrman分级呈正相关，MVD越高，Fuhrman分级越高，这与之前的研究结果不同[27]。原因可能是本研究将Fuhrman Ⅲ及Ⅳ级患者归为高级别组且FuhrmanⅣ级的患者仅有6例，免疫组化结果显示Fuhrman Ⅳ级患者的MVD值最小，Fuhrman Ⅲ级的MVD较Ⅱ级肿瘤略高，故导致MVD值与病理Fuhrman分级呈正相关的结果。在以后的研究中笔者还将扩大Ⅰ级和Ⅳ级患者的样本量进行四种病理分级的研究。

另外有一些研究表明，利用不需外源性示踪剂的MRI技术，如动脉自旋标记成像(arterial spin labeling,ASL)，也可用于肾脏肿瘤良恶性及不同病理分级的鉴别诊断，但ASL的扫描技术及对MR灌注参数的计算较IVIM-DWI更具挑战性[26]。未来笔者可以将ASL-DWI联合扫描技术用于肾肿瘤的病理分级及良恶性的评估研究中，可能会进一步阐释肾脏肿瘤特别是CCRCC的微环境。

本研究存在以下局限性：首先，本研究样本量较小，尤其Fuhrman Ⅳ级患者只有6例，主要是多数Ⅳ级CCRCC患者发现时已经发生转移或伴静脉癌栓，未来还需更大样本量的前瞻性研究来评估验证我们的初期结论。其次，虽然当肿瘤信号不均匀时，笔者选择2～3个实性部分区域进行ROI的勾画，取其平均值，但为了减少容积效应尽量将ROI放置于肿瘤的中心位置，导致获取的参数不能充分评估肿瘤组织的异质性。最后，本研究仅对肿瘤实性部分进行了IVIM-DWI分析，忽略了肿瘤的囊变坏死区域对IVIM-DWI参数的影响。故以后在对肾脏肿瘤定量影像特征的研究中还需将全肿瘤ROI技术纳入研究并进行分析比较。

综上所述，基于IVIM-DWI参数在不同病理分级CCRCC之间的差异及其与MVD的相关性，笔者认为IVIM-DWI可作为一种无创评估术前不同病理分级CCRCC的影像手段,达到术前评估预后的目的。DWI成像速度快且不需要使用外源性对比剂，对于一部分合并有侵袭性基础疾病、适合随访的肾脏小肿瘤、老年人或肝肾功能不全患者具有良好的应用前景，可为临床随访或主动监测提供一种无创的影像方法。