PGC-1α调控OPA1改善阿尔茨海默病的机制研究

刘文君， 史厚珍， 翟鸿儒， 张维君， 朱永强， 刘子重， 王玉召， 王佳,

(1. 江苏大学医学院，江苏 镇江 212013； 2. 江苏大学附属第四人民医院神经科，江苏 镇江 212001； 3. 滨海县人民医院护理部，江苏 盐城 224500)

阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease, AD)是一种神经退行性疾病，其主要病理学特征是β-淀粉样蛋白(Amyloid-β, Aβ)沉积，神经纤维缠结以及进行性神经元和突触丢失[1]。AD的发病机制尚未被完全阐明，胆碱能损伤[2]、神经炎症[3]、自噬异常[4]、氧化应激[5]、线粒体功能障碍[6]等多种复杂的病理生理过程都与AD的发生有关。近年来研究发现，线粒体功能障碍在AD的发病机制中起着至关重要的作用[7]。AD患者大脑中Aβ的进行性积累可能导致线粒体功能障碍，包括线粒体结构受损、ATP水平降低，线粒体生物合成降低以及线粒体动力学异常[8]。线粒体是一种高度动态的细胞器，处于一种连续不断的融合和分裂的动态过程，这些持续不断的运动能有效调节线粒体的形态，控制线粒体在细胞内的分布，以适应细胞生长、分裂、分化过程。线粒体通过快速和可逆的分裂、融合过程，可完成从小圆形细胞器到巨大管状结构的转变，位于线粒体外膜的线粒体融合素1(Mitofusin 1, Mfn1)、线粒体融合素2(Mitofusin 2, Mfn2)及线粒体内膜中视神经萎缩症蛋白1(optic atrophy 1, OPA1)共同协作完成了线粒体的融合[9]，已有研究证实线粒体的融合对于其功能的维持至关重要。干扰线粒体的融合，如OPA1的丢失能够减少线粒体的氧化磷酸化，降低线粒体的膜电势。在线粒体的融合-分裂过程中，OPA1作为线粒体内膜融合蛋白，对维持线粒体内膜的完整性和线粒体嵴的结构起决定性作用[10]。研究表明，OPA1在线粒体能量维持上也发挥着至关重要的作用[11]，增加OPA1水平可以同时增强线粒体融合和ATP的产生[12]。

近年来，越来越多的证据显示AD的发生与神经元线粒体融合失衡密切相关。AD患者脑组织解剖学研究发现，其海马神经元线粒体数目明显减少，并伴随着线粒体结构破坏，如线粒体嵴断裂、内部结构丢失及出现短棒状线粒体[13]。体外研究也已证实转染了APP质粒的M17细胞出现大量定位于细胞核的碎片化的线粒体，上述线粒体形态及分布的异常伴随着线粒体融合蛋白表达的改变[14]。

PGC-1α作为过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ, PPARγ)转录共激活因子能够促进线粒体生物合成及抗氧化酶基因的转录而被定义为代谢调节靶点[15]。PGC-1α主要存在于高能量需求的组织，如心脏、肝脏、骨骼肌和脑[16]。许多神经生物学疾病的发生都与其脑组织PGC-1α表达下调、抗氧化酶减少及活性氧簇诱导的线粒体功能障碍密切相关[17]，如γ-氨基丁酸能神经元敲除PGC-1α能够模拟精神分裂症的行为学表型[18]。PGC-1α通过调控基因和环境的相互作用影响了神经突触的可塑性[18]。帕金森氏综合征的尸检报告提示，患者黑质脑区PGC-1α显著下调，同时伴随线粒体融合蛋白表达的降低[19]。然而，在AD中PGC-1α究竟扮演了什么样的角色？PGC-1α是否参与了AD神经元线粒体动力学调控？PGC-1α能否调控OPA1的转录及表达，继而改善AD神经元线粒体的动力学反常？

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂与抗体 细胞培养基(美国Invitrogen公司)，化学试剂(美国Sigma-Aldrich公司)，脂质体转染试剂DNAfection(镇江爱必梦生物科技有限公司)，DAB显色试剂盒、免疫组化试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)，4′, 6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐(DAPI)、DEPC水(上海碧云天生物技术公司)，RNA提取试剂盒(南京诺唯赞生物科技有限公司)，cDNA逆转录试剂盒(美国Thermo公司)。Aβ抗体(美国CST公司)，PGC-1α抗体(北京博奥森生物技术有限公司)，OPA1抗体(武汉博士德生物工程有限公司)，免疫荧光二抗：Alexa Fluor 594-山羊抗兔IgG(美国CST公司)，DyLight 488-山羊抗小鼠IgG(武汉博士德生物工程有限公司)。

1.1.2 质粒和腺相关病毒 APPswe质粒，PGC-1α质粒均由武汉淼灵生物科技有限公司构建。pAAV-MCS-PGC1α-m-FLAG-HA，pAAV-MCS-FLAG-control腺相关病毒购自和元生物技术(上海)有限公司。

1.1.3 细胞系 N2A神经母细胞瘤细胞购自美国ATCC公司。

1.1.4 实验动物 APP/PS1双转基因AD模型小鼠购自美国Jackson实验室，C57BL/6(WT)小鼠购自江苏集萃药康生物科技股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 脂质体转染 细胞培养至密度为70%时，使用DNAfection进行脂质体转染，管1：200 μL选择性培养基(Opti-MEM)+2 μg DNA；管2：200 μL Opti-MEM+5 μL DNAfection；混匀，静置5 min；管1+管2，混匀，静置25 min；加入N2A细胞中，次日收集细胞。转染细胞活力通过细胞免疫荧光或DAPI染色确定。

1.2.2 RNA提取 质粒转染24 h后，收集细胞，RNA提取试剂盒提取RNA：6孔板每孔加入500 μL裂解液，吹打细胞，转移至离心管中，反复吹打裂解细胞。向细胞裂解液中加入200 μL DEPC水，混匀后静置5 min，12 000×g室温离心、15 min，转移水相至新的离心管，加入等量异丙醇抽提RNA，混匀后静置10 min，12 000×g室温离心、10 min，弃上清液，加入75%乙醇清洗沉淀，8 000×g室温离心、5 min，弃上清液并晾干，加入20 μL DEPC水溶解沉淀。

1.2.3 RNA逆转录为cDNA 向RNA沉淀中加入20 μL DEPC水，测试浓度后，按照cDNA逆转录试剂盒说明书将RNA逆转录成cDNA。

1.2.4 qRT-PCR检测APP、PGC-1α和OPA1的mRNA水平 取200 ng cDNA以20 μL体系进行qRT-PCR检测，以β-肌动蛋白的mRNA作为内参对照，反应条件：95 ℃预变性10 min；95 ℃ 变性15 s，58 ℃ 退火15 s，72 ℃ 延伸30 s，共40个扩增循环。qRT-PCR引物：APP上游5′-TGAATGTGCAGAATGGAAAGTG-3′，下游5′-AACTAGGCAACGGTAAGGAATC-3′；PGC-1α上游5′-GGATATACTTTACGCAGGTCGA-3′，下游5′-CGTCTGAGTTGGTATCTAGGTC-3′；OPA1上游5′-CTTACATGCAGAATCCTAACGC-3′，下游5′-CCAAGTCTGTAACAATACTGCG-3′。

1.2.5 脑区定点微注射AAV-PGC1α 将APP/PS1小鼠麻醉后固定于脑立体定位仪上，使用微量注射器向侧顶叶联合皮层(lateral parietal association cortex, LPtA)(前囟点-1.94 mm，侧面±1.5 mm，深度-1.0 mm)注射0.5 μL腺相关病毒(pAAV-MCS-PGC1α-m-FLAG-HA或pAAV-MCS-FLAG-control)。

1.2.6 苏木素-伊红染色观察注射位点 小鼠灌注取脑，经4%多聚甲醛固定过夜后脱水，包埋，切片。石蜡切片脱蜡至水处理，放于苏木素染液中染色5～10 min，用1%盐酸乙醇溶液分化数秒，伊红染液染色1～3 min，染色后的切片脱水透明后，中性树脂封片。

1.2.7 免疫荧光染色检测Aβ和PGC-1α阳性细胞数目 小鼠灌注取脑后石蜡切片，石蜡切片二甲苯脱蜡，梯度乙醇复水，将切片置于柠檬酸盐抗原修复液中微波辐射抗原修复，0.3% TritonX-100穿透细胞30 min，5% BSA+5% 山羊血清封闭90 min，Aβ抗体(1 ∶1 000)和PGC-1α抗体(1 ∶1 000)4 ℃孵育过夜，荧光二抗室温孵育90 min，DAPI核染10 min，封片。

1.2.8 免疫组织化学染色检测OPA1阳性细胞数目 小鼠灌注取脑后，石蜡包埋、切片，石蜡切片脱蜡与复水，将切片放入3%过氧化氢溶液中孵育10 min以消除内源性过氧化物酶的干扰，抗原修复、穿透细胞、封闭相关步骤同方法“1.2.7”，4 ℃过夜孵育OPA1抗体(1 ∶1 000)、二抗室温孵育30 min，滴加DAB显色，梯度乙醇脱水，中性树脂封片。

1.2.9 透射电镜观察线粒体形态 小鼠灌注取脑后，取脑组织浸于固定液中4 ℃固定24 h，乙醇梯度脱水后包埋。样品在LEICA EM UC7型超薄切片机中切片，切片经柠檬酸铅溶液和醋酸双氧铀50%乙醇饱和溶液各染色5～10 min，晾干后透射电镜观察。

1.3 统计方法

2 结果

2.1 AD小鼠模型及N2A细胞模型PGC-1α表达及转录水平降低

以6月龄APP/PS1小鼠作为AD体内模型。通过免疫荧光染色检测AD模型小鼠LPtA脑区Aβ沉积和PGC-1α蛋白的表达，与WT小鼠相比，APP/PS1小鼠LPtA脑区Aβ沉积显著增加(t=9.71，P<0.01)，验证了模型的有效性。值得注意的是，AD小鼠LPtA脑区PGC-1α的表达显著下调(t=9.28，P<0.01)。N2A细胞系脂质体法转染APPswe构建AD体外模型，qRT-PCR检测AD组PGC-1α的转录水平，与对照组相比，AD模型组APP转录水平的增加(t=4.92，P<0.01)伴随着PGC-1α转录水平的下降(t=8.54，P<0.01)。见图1。

A-B：体内水平评价WT及APP/PS1小鼠LPtA脑区Aβ的表达和定量；C-D：体内水平评价WT及APP/PS1小鼠LPtA脑区PGC-1α的表达和定量;E-F：N2A细胞系脂质体法转染PCDNA对照质粒或APPswe质粒，体外水平评价对照组及N2A细胞模型组APP mRNA及PGC-1α mRNA的相对表达(图B的定量面积为1.35 mm2，图C的定量面积为0.1 mm2，比例尺=100 μm，n=6)

2.2 AD小鼠模型及N2A细胞模型OPA1表达及转录水平的降低

以AD模型小鼠为研究对象，通过免疫组化评价OPA1的表达水平，与WT对照组相比，APP/PS1小鼠LPtA脑区OPA1表达降低(t=6.49，P<0.01)。N2A细胞系转染APPswe构建AD体外细胞模型，qRT-PCR证实mutAPP引起OPA1转录水平降低(t=3.28，P<0.01)。见图2。

A-B：体内水平评价WT及APP/PS1小鼠LPtA脑区OPA1的免疫组化和定量分析；C：N2A细胞系脂质体法转染PCDNA质粒或APPswe质粒。体外水平评价对照组及N2A细胞模型组OPA1 mRNA的相对表达(图B的定量面积为0.03 mm2，比例尺=100 μm，n=6)

2.3 AD模型小鼠线粒体形态异常

透射电镜观察显示，与WT对照组相比，APP/PS1小鼠LPtA脑区神经元线粒体形态受损，内膜损伤的线粒体数目显著增多(t=6.29，P<0.01)。见图3。

A：体内水平评价WT及APP/PS1小鼠LPtA脑区神经元线粒体形态学改变(透射电镜)；B：内膜损伤的线粒体数量百分比(比例尺=200 nm，n=6)

2.4 PGC-1α抑制了AD时Aβ的转录与表达

利用脑区定点微注射及AAV介导的基因转导技术(pAAV-MCS-PGC1α-m-FLAG-HA)，诱导PGC-1α在AD模型鼠LPtA过表达，实验结束后，HE染色确认灌注位点是否正确，若偏离注射位点，则该样本的相关数据将被剔除。

利用免疫荧光技术验证AD模型组及PGC-1α过表达组小鼠LPtA Aβ沉积及PGC-1α的表达情况。与AD模型组相比，PGC-1α在AD模型鼠LPtA成功过表达(t=5.49,P<0.01)，且PGC-1α显著降低了AD模型小鼠LPtA的Aβ沉积(t=4.62，P<0.01)。

N2A细胞系共转APPswe和PECMV/PGC-1α质粒，qRT-PCR检测两组APP和PGC-1α的转录水平， PGC-1α转录水平明显增加(t=7.25，P<0.01)，与N2A细胞模型组相比，PGC-1α显著降低了N2A细胞模型组Aβ的转录水平(t=9.52，P<0.01)。见图4。

A：小鼠大脑冠状切片苏木素-伊红染色图；B-C：体内水平确定PGC-1α在APP/PS1小鼠LPtA脑区过表达；D-E：体内水平评价PGC-1α过表达对APP/PS1小鼠LPtA脑区Aβ沉积的影响；F-G：N2A细胞系共转APPswe和PECMV/PGC-1α质粒，qRT-PCR确认PGC-1α mRNA的相对表达，体外水平评价PGC-1α对Aβ mRNA水平的影响(图C的定量面积为0.1 mm2，图D的定量面积为1.35 mm2，比例尺=100 μm，n=6)

2.5 PGC-1α改善了AD发生时OPA1水平的降低

免疫组化验证PGC-1α过表达对AD小鼠模型LPtA脑区OPA1表达的影响，与对照组(APP/PS1+Vector)相比，PGC-1α过表达显著增加了AD模型小鼠(APP/PS1+PGC-1α)LPtA脑区OPA1的表达(t=4.09，P<0.01)。N2A细胞系共转APPswe和PECMV/PGC-1α质粒，qRT-PCR检测OPA1的转录水平，与对照组(APPswe+PECMV)相比，PGC-1α表达显著增加了N2A细胞模型组(APPswe+PGC-1α)OPA1的转录水平(t=4.86，P<0.01)。见图5。

A-B：体内水平评价PGC-1α过表达对APP/PS1小鼠LPtA脑区OPA1表达的影响；C：N2A细胞系共转APPswe和PECMV/PGC-1α质粒，qRT-PCR评价PGC-1α对OPA1 mRNA水平的影响(图B的定量面积为0.03 mm2，比例尺=100 μm，n=6)

2.6 PGC-1α改善了AD发生时线粒体的损伤

透射电镜检测PGC-1α过表达对AD模型小鼠LPtA脑区神经元线粒体形态的影响，与AD模型组小鼠相比，PGC-1α过表达显著改善了AD小鼠LPtA神经元线粒体内膜的损伤，线粒体内膜的完整性增加(t=5.72，P<0.01)。见图6。

A：体内水平评价PGC-1α过表达对APP/PS1小鼠LPtA脑区神经元线粒体形态的影响(透射电镜)；B：内膜损伤的线粒体百分比的量化(比例尺=200 nm，n=6)

3 讨论

近年来，线粒体的动力学改变成为神经生物学领域研究的热点。线粒体通过快速和可逆的分裂、融合过程，可完成从小圆形细胞器到巨大管状结构的转变，OPA1主要定位于线粒体内膜上控制内膜的融合。线粒体内膜的边界膜和线粒体嵴的交界部分会形成一个结构—嵴连接[20]。线粒体嵴上锚定着大量的与细胞氧化磷酸化和ATP生成相关的重要蛋白，包括呼吸链复合物和ATP合成酶。OPA1通过形成聚合体来加强嵴连接点的强度，增加呼吸链复合物的稳定性，从而促进线粒体的氧化呼吸效率[21-23]。

越来越多的证据显示AD的发生与神经元线粒体动力学异常(融合、分裂失衡)密切相关。AD患者脑组织解剖学研究发现，其海马神经元线粒体数目明显减少，并伴随着线粒体结构破坏，如线粒体嵴断裂、内部结构丢失及出现短棒状线粒体[8]。体外研究也证实转染了APP质粒的M17细胞出现大量定位于细胞核的碎片化的线粒体，上述线粒体形态及分布的异常伴随着线粒体融合及分裂蛋白表达的变化[24]。

PGC-1α作为PPARγ转录共激活因子在线粒体生物发生、线粒体质量控制和能量代谢的过程中起到关键作用。许多神经生物学疾病的发生都与其脑组织PGC-1α表达下调、抗氧化酶减少及活性氧诱导的线粒体功能障碍密切相关。如帕金森氏综合征的尸检报告显示患者黑质脑区PGC-1α显著下调，同时伴随线粒体融合蛋白表达的降低[19]。本课题组前期通过体内实验已经证实AD的发生伴随着PGC-1α表达水平的降低及氧化应激产物—DNA损伤标志物8-羟基脱氧鸟苷增加[25]。然而，PGC-1α能否改善AD神经元线粒体动力学异常及其潜在的机制尚不清楚。

本研究通过体内、体外实验首先评价了AD发生时PGC-1α、OPA1的转录及表达水平。结果表明，无论在AD动物模型或APPswe转染构建的N2A细胞模型中，PGC-1α、OPA1转录及表达水平均明显下降。进一步利用透射电镜观察了线粒体形态变化，与Calkins课题组的研究结果一致[8]，APP/PS1小鼠的侧顶叶联合皮层神经元线粒体的内膜溶解、破坏，并伴随线粒体的嵴断裂。尽管研究证实AD时神经元线粒体形态的改变与PGC-1α及OPA1表达下调有关，然而PGC-1α能否改善AD的发生，是否通过调控线粒体的融合发挥作用还有待进一步探索。

利用6月龄APP/PS1小鼠作为研究对象，通过脑区定点微注射pAAV-MCS-PGC1α-m-FLAG-HA腺相关病毒成功诱导PGC-1α在AD小鼠侧顶叶联合皮层过表达。PGC-1α过表达可以显著降低AD所伴随的Aβ沉积。值得注意的是，PGC-1α显著增加了AD组OPA1的转录和表达水平，并且改善了AD所伴随的线粒体的嵴断裂和内膜结构。结果表明，PGC-1α很可能通过调控线粒体的内膜融合蛋白OPA1的表达，抑制线粒体形态的损伤，从而达到改善AD的目的。

此外，本研究以N2A细胞系为研究对象，脂质体法共转APPswe和PECMV/PGC-1α质粒，qRT-PCR评价了PGC-1α过表达对N2A细胞模型中PGC-1α、OPA1及Aβ转录水平的调控，与体内结果一致，PGC-1α显著抑制了APPswe转染组Aβ的转录，该结果伴随着OPA1转录水平的增加。PGC-1α抑制AD神经元线粒体形态的损伤及改善Aβ病理学沉积与其增加OPA1的转录及表达水平密切相关。

OPA1的表达经过选择性剪接和蛋白水解过程，产生多种变体形式，包括线粒体内膜锚定的长链OPA1(long OPA1, L-OPA1)和可溶性短链OPA1(short OPA1, S-OPA1)。研究发现，L-OPA1不仅可以维持嵴的紧密性，对线粒体融合能力的维持也是不可或缺的[21，26]，而S-OPA1是否可以参与线粒体融合，存在争议[10，21]。有研究证明，S-OPA1在线粒体融合中的作用很小，但可以独立于L-OPA1维持呼吸功能，在能量维持中发挥作用[27]，支持嵴的形成，维持嵴的紧密性[28]。这些研究表明，OPA1对嵴的维持作用独立于线粒体融合的调控。本研究发现AD的发生伴随着OPA1表达降低和线粒体嵴的损伤，而PGC-1α可以改善此现象。根据文献报道，L-OPA1既可以维持嵴的结构，又可以参与线粒体融合，而S-OPA1对线粒体嵴的维持独立于线粒体融合的作用。PGC-1α调控OPA1的具体机制以及在AD中对L-OPA1和S-OPA1的调控，有待进一步研究。

综上所述，AD的发生伴随PGC-1α和OPA1的转录及蛋白表达水平下降。PGC-1α通过调控OPA1的表达，改善AD所伴随的线粒体内膜损伤。PGC-1α很可能为AD的潜在调控位点，当前的研究对AD的机制探索及靶向药物研发具有重要价值。PGC-1α对线粒体AD融合调控的分子生物学机制有待进一步研究。