大黄鱼内脏白点病的病原分离鉴定及致病性

饶秋华, 刘 洋, 黎 露, 张志灯, 邱 睿, 何肖云, 黄 薇, 罗 钦, 罗土炎

[1.福建省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所/福建省农产品质量安全重点实验室，福建 福州 350003；2.福建农林大学动物科学学院(蜂学学院)/海洋研究院/福建省海洋生物技术重点实验室，福建 福州 350002；3.福州海关技术中心，福建 福州 350003；4.大连海洋大学水产和生命学院，辽宁 大连 116023]

大黄鱼(Larimichthyscrocea)隶属于石首鱼科(Sciaenidae)黄鱼属(Larimichthys)，俗称黄瓜鱼.2020年我国人工养殖大黄鱼总量达254 062 t[1].大黄鱼味道鲜美、肉质细嫩、营养丰富，被誉为我国东海的“四大海产”之一[2].近年来我国人工网箱养殖大黄鱼的病害发生频率急剧上升，在很大程度上限制了大黄鱼养殖业的健康发展.造成这一情况发生的原因主要包括当今养殖环境不断发生变化、海水污染加重、网箱养殖规模不断扩大、养殖布局不合理、养殖密度过高等[3].大黄鱼内脏白点病是网箱养殖的常见病害之一，死亡率高达70%～80%，给大黄鱼养殖带来了巨大的经济损失[4].大黄鱼内脏白点病的高发期为冬末和春初，2月份网箱养殖的发病率较高，水温为15 ℃时最为流行，发病周期为1～3个月.大黄鱼内脏白点病为慢性细菌病，所有规格的大黄鱼均可感染此病.早期患病大黄鱼会出现反应迟钝等现象，但基本不会死亡，患病后期解剖可见肝脏、肾脏和脾脏等有0.5～3 mm大小不等的白色结节,肌肉失去弹性，故称此病为内脏白点病[5].已有学者对大黄鱼内脏白点病致病菌进行了分离鉴定和致病性研究，其病原菌有杀香鱼假单胞菌[6-7]、荧光假单胞菌[8]、恶臭假单胞菌[9]和铜绿假单胞菌[10]等.

假单胞菌(Pseudomonas)是一种专性需氧的革兰氏阴性、无芽胞、有荚膜杆菌,略弯曲或呈杆状，菌体大小为(0.5～1) μm×(1.5～4) μm，有端生鞭毛、能运动，绝大多数菌株的适宜生长温度为30 ℃，在土壤、淡水和海水环境中普遍存在，部分菌株可产生荧光色素或红黄蓝绿等水溶性色素.本研究从福建省福州市连江县某养殖场患病大黄鱼体中分离到一株优势菌株，命名为DGZ5.对该菌进行形态学观察、生理生化特性鉴定、16S rRNA基因序列分析以及毒力基因检测、药物敏感性试验、致病性试验，旨在为大黄鱼细菌病害防治提供科学依据.

1 材料与方法

1.1 材料

患内脏白点病的大黄鱼来源于福建省福州市连江县某养殖场.用于人工回归感染试验的健康大黄鱼来源于同一养殖场，体重100～150 g，体长10～15 cm，在水温为19～21 ℃的大圆桶中暂养7 d，观察期间无发病和死亡后开始进行人工回归感染试验.

BHI琼脂培养基和LB液体培养基购于北京陆桥技术有限责任公司；全自动微生物鉴定仪及相关试剂购于生物梅里埃公司；细菌基因组DNA提取试剂盒购于北京庄盟国际生物基因科技有限公司；TaqDNA聚合酶购于TaKaRa生物股份有限公司；抗生素药敏纸片购于杭州微生物试剂有限公司.试验所用引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成.

1.2 自然患病鱼症状和病理切片的观察

现场观察病鱼的采食、行为特点和临床症状等，采集病鱼置于白色搪瓷盘中，检查病鱼体表和内脏组织.取正常大黄鱼和患病大黄鱼的肝脏、肾脏组织，用Bouin氏液固定24 h，经75%乙醇洗涤数次，再用不同浓度的乙醇逐级脱水及丙酮脱水，移入二甲苯溶液中透明，石蜡包埋,切片，HE染色后置于显微镜下观察并拍照[11-12].

1.3 病原菌的分离纯化

采用医用酒精对病鱼的体表进行消毒，在无菌条件下解剖患病大黄鱼，将明显感染白点病的肝脏和肾脏等组织划线接种于BHI琼脂培养基中，于28 ℃培养48 h后观察分离菌的生长情况.取培养皿中的优势菌落再次划线接种到BHI琼脂培养基中，进行再一次的分离纯化，经28 ℃培养48 h后，最后挑取单菌落接种到LB液体培养基中，待菌生长至对数期时，置甘油(-80 ℃)冻存备用.

1.4 病原菌形态学观察和生理生化特性鉴定

1.4.1 形态学观察 用无菌接种环蘸取BHI琼脂培养基上的DGZ5菌苔均匀涂抹在载玻片上进行革兰氏染色，染色后置于生物显微镜下观察菌株的形态.

1.4.2 生理生化特性鉴定 用无菌接种环从BHI琼脂培养基上刮取适量的DGZ5菌苔于灭菌生理盐水中，充分振荡混匀，于浊度仪中调制0.5～0.63麦氏浊度的菌悬液.取菌悬液加在鉴定卡中，置于全自动微生物鉴定仪中读取生理生化特性鉴定结果.

1.5 病原菌16S rRNA基因的PCR扩增

利用细菌基因组提取试剂盒提取DGZ5菌株的总基因组DNA，以基因组DNA为模板，使用细菌通用引物扩增16S rRNA基因序列，将PCR扩增产物提交到生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序.将测序结果提交到NCBI GenBank数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)进行BLAST比对，获取与DGZ5菌株16S rRNA 基因序列相似度较高的序列，使用MEGA 5.0软件采用邻接法(NJ)构建系统进化树，自举分析(Bootstrap)1 000次重复检测分子系统树的置信度.

1.6 病原菌毒力基因的检测

以DGZ5菌株基因组DNA作为PCR模板，分别对18种毒力基因进行扩增测序.PCR反应体系：1 μL模板、上下游引物各1 μL、25μL 2×TaqPCR Master Mix、22 μL ddH2O.反应程序：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s；52～68 ℃退火50 s；72 ℃延伸30 s；72 ℃再延伸10 min.将PCR扩增产物提交到生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序.引物信息如表1所示.

表1 18种毒力基因PCR检测的引物信息Table 1 PCR primer information of 18 virulence genes

1.7 病原菌人工回归感染试验

将健康大黄鱼暂养7 d后随机分成6组，每组30尾.采用腹腔注射法，按照0.5 mL·尾-1的剂量注射不同浓度的菌液感染健康大黄鱼.A、B、C、D、E组健康大黄鱼分别注射1×109、1×108、1×107、1×106、1×105cfu·mL-1DGZ5菌液，同时设注射0.5 mL·尾-1磷酸盐缓冲液的对照组，每个试验组设置3个平行.连续观察7 d，记录大黄鱼发病和死亡情况，计算7 d总平均死亡率.利用SPSS 22软件参考熊浩明等[18]的方法计算DGZ5菌株对健康大黄鱼的半致死浓度(median lethal concentration， LD50).取患病大黄鱼的内脏组织进行细菌的分离、培养、鉴定，再次确定致病菌.取人工感染患病大黄鱼的肝脏和肾脏组织，按照“1.2”的方法进行病理切片及染色后观察.

1.8 病原菌抗生素敏感性试验

采用纸片扩散法(K-B法)鉴定DGZ5菌株对36种抗生素药物的敏感性，每种抗生素药物设置3个重复.于28 ℃培养24 h后用游标卡尺测定DGZ5菌株对每种药物的抑菌圈直径.取抑菌圈直径的平均值计算药物敏感度，根据欧盟药敏试验标准判定菌株对药物的敏感度[19].质控菌株为ATCC25922大肠埃希氏菌.

2 结果与分析

2.1 病鱼症状和分离菌的形态

A：病鱼症状；B：DGZ5菌株的形态(标尺:2.0 μm).图1 病鱼症状及DGZ5菌株的形态Fig.1 Symptoms of diseased fish and morphology of strain DGZ5

患病大黄鱼体表无明显变化，但解剖可见其肝脏、脾脏和肾脏出现直径为0.5～2 mm的白色结节病灶(图1A).从典型发病症状的大黄鱼肝脏中分离到一株优势菌，命名为DGZ5.该菌在BHI琼脂培养基上生长良好，于28 ℃培养48 h后可见直径为1～3 mm、边缘整齐、光滑、湿润、不透明的乳白色圆形菌落.透射电子显微镜下观察可见，DGZ5菌株长1.91～2.39 μm，宽 0.86～1.05 μm，端生1～2根鞭毛(图1B)，为革兰氏阴性杆状细菌.

2.2 分离菌16S rRNA基因序列

测序结果显示，DGZ5菌株16S rRNA基因序列长度为1 430 bp.使用MAGA 5.0软件，采用邻接法构建系统发育树.结果(图2)显示，DGZ5菌株与杀香鱼假单胞菌(PseudomonasplecoglossicidaKC345028.1T)、荧光假单胞菌(PseudomonasfluorescensMN256402.1T)、恶臭假单胞菌(PseudomonasputidaMK849866.1T)聚集在一个分支上，其16S rRNA基因序列的相似度分别为100%、99.8%和99.6%，进一步表明菌株隶属于假单胞菌.综上，确定DGZ5菌株为杀香鱼假单胞菌.

图2 DGZ5菌株基于16S rRNA基因序列的系统发育树Fig.2 Neighbour-joining phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequences of strain DGZ5

2.3 分离菌毒力基因检测结果

采用PCR扩增方法对DGZ5菌株的18种毒力基因进行检测.结果(图3)显示，编号为EPB94769.1的基因序列长498 bp、ompA基因序列长714 bp、sigX基因序列长567 bp、flgM基因序列长315 bp、secY基因序列长1 332 bp.测序结果显示，这些序列与文献[13-15]中的序列相似度较高，达到97%以上，说明其携带secY、ompA、sigX、flgM及编号为EPB94769.1的5种毒力基因.

M:Marker；1：编号为EPB94769.1的基因；2～18依次为ompA、sigX、flgM、secY、RK21_RS10315、plcH、aprA、algD、exoS、exoT、exoU、exoY、toxA、pys、oaclR、norC、dksA基因.图3 18种毒力基因PCR检测电泳图谱Fig.3 Gel electrophoresis of PCR products of 18 virulence genes

2.4 分离菌生理生化特性鉴定结果

对人工感染患病大黄鱼体内分离的菌株与自然患病大黄鱼肝脏中分离的DGZ5菌株进行生理生化特性鉴定.结果(表2)显示，分离菌株均为假单胞菌，检测结果的置信度高.

表2 DGZ5菌株生理生化特性鉴定结果1)Table 2 Physiological and biochemical characteristics of strain DGZ5

2.5 分离菌人工回归感染试验结果及病理特征

用不同浓度的DGZ5菌液对健康大黄鱼进行人工回归感染试验，连续观察7 d.结果(表3)显示：感染3 d后，A组大黄鱼全部死亡，总平均死亡率达100%；B、C、D组的大黄鱼感染4 d后不再死亡，总平均死亡率依次为77.8%、56.7%、25.6%；E组和对照组在观察期间未见大黄鱼死亡.经计算，DGZ5菌株对大黄鱼的LD50为8.07×106cfu·mL-1.

表3 DGZ5菌株人工回归感染试验结果Table 3 Artificial infection results of strain DGZ5 to L.crocea

在腹腔注射接种DGZ5菌液后，试验组大黄鱼感染初期表现为游动缓慢、应激反应迟钝等临床症状；患病或濒死患病大黄鱼的肝脏和肾脏出现白色结节，与自然发病大黄鱼组织病变相似.此外，在感染患病大黄鱼肝脏再次分离得到的致病菌与DGZ5菌株的形态、生理生化特性一致.可见，本研究分离的DGZ5菌株为导致大黄鱼患内脏白点病的病原菌.

与健康大黄鱼相比，在人工感染和患病大黄鱼的肝脏和肾脏中均可观察到显著的组织病理变化，有典型的肉芽肿，并伴有脂肪变性和炎性细胞浸润等现象.

健康大黄鱼肝脏具有色泽一致、质地均匀、组织结构排列清晰的特征，其实质细胞为近似椭圆的多角形细胞，以中央静脉为中心向四周呈放射状排列，部分胰脏组织嵌入肝脏组织中，胰腺细胞间的结缔组织经HE染色后呈紫蓝色，呈现较强的嗜碱性(图4A)；患有内脏白点病的大黄鱼肝脏呈现明显的脂肪变性，此即为肉眼观察到的“白点”，经 HE 染色后可见大量的空泡(图4B)；健康大黄鱼肾小球为毛细血管围成的血管球，构成肾小管的单层上皮细胞排列紧凑、界限清晰，肾间质组织致密，并与肾小球、肾小管紧密嵌合(图4C)；患有内脏白点病的大黄鱼肾脏病变严重，肾小球萎缩变形甚至开始崩解，肾间质出现大面积组织坏死和崩解并形成结节，部分坏死组织呈淀粉样变性(图4D).

A:健康大黄鱼肝脏; B:病鱼肝脏; C:健康大黄鱼肾脏; D:病鱼肾脏(箭头表示淀粉样变性组织).图4 病鱼肝脏和肾脏组织的病理变化(×100)Fig.4 Pathological changes of liver and kidney tissues of diseased fishes (×100)

2.6 分离菌对抗生素的药敏性

药敏试验结果(表4)显示：DGZ5菌株对头孢他啶、庆大霉素、丁胺卡那、新霉素和卡那霉素等12种抗生素药物高度敏感；对氟苯尼考、米诺环素、四环素、头孢曲松、头孢哌酮和哌拉西林6种抗生素药物中度敏感；对青霉素、阿莫西林、氨苄西林和羧苄西林等18种抗生素药物耐药.

表4 DGZ5菌株对抗生素药物的敏感性Table 4 Antibiotics susceptibility of strain DGZ5

3 讨论

本研究从患内脏白点病大黄鱼肝脏处分离纯化出一株优势菌株，命名为DGZ5，通过形态学观察、生理生化特性鉴定、16S rRNA基因序列分析确定该菌株隶属于假单胞菌，鉴定为杀香鱼假单胞菌.杀香鱼假单胞菌为革兰氏阴性菌，最早由日本患病的香鱼中分离出来.杀香鱼假单胞菌除了极少数能降解污染物而应用到环境污染治理中[20]，大部分对硬骨鱼具有高致病性，导致各种养殖鱼类的高死亡率.在国内，杀香鱼假单胞菌与海水养殖鱼类大黄鱼[21]、橙斑石斑鱼(Epinepheluscoioides)[22]的“内脏白点病”有关，每年造成数百万元的经济损失.鉴于其对水产养殖业的巨大影响，杀香鱼假单胞菌的生物学特性和致病机制备受关注.

毒力基因在病原菌感染宿主的过程中起着重要作用[23].本研究结果显示，DGZ5菌株携带ompA、sigX、flgM、secY以及编号为EPB94769.1的5种毒力基因.研究表明：ompA基因主要存在于革兰氏阴性细菌中，在入侵细胞时起黏附作用，是病原菌致病作用的一个重要组成成分[24-25]；sigX基因是细菌DNA 转录时的正调控因子，影响膜的流动性以及菌株的营养代谢反应，也与细菌的黏附有关[25-26]；flgM基因能够参与合成细菌的鞭毛以及其他生物功能活动[26-27]，从而间接地影响致病菌的黏附、定殖、侵袭及生物被膜的形成[16,27].研究表明，与体外培养的杀香鱼假单胞菌相比，感染橙斑石斑鱼的杀香鱼假单胞菌的转录调节基因RK21_RS10315[16]、RNA聚合酶δ因子基因sigX、鞭毛生物合成抗δ因子基因flgM[14]及大黄鱼脾脏中杀香鱼假单胞菌的前蛋白转位酶亚基基因secY[15]，其表达量均显著提高，且感染了携带以上基因的沉默菌株的橙斑石斑鱼或大黄鱼的死亡率均有所下降，表明以上基因的表达、调控与杀香鱼假单胞菌发挥毒力的作用有关.DGZ5菌株携带了5种毒力基因，为该菌株的致病性提供了生物学基础.严良[13]分离得到了一株杀香鱼假单胞菌LQJ06，毒力基因检测结果显示，其携带flgM、sigX、RK21_RS10315及编号为P2(EPB94930.1)的OmpA基因片段，其中，flgM基因为重要的毒力因子，不同的是DGZ5菌株未携带RK21_RS10315基因.DGZ5菌株亦携带了flgM毒力基因，测序结果显示与报道的flgM基因[14]呈现97%的相似性，可能是其重要的致病因子.通过对DGZ5菌株毒力基因的检测，能够更加全面地了解其致病机制和致病性.

杀香鱼假单胞菌是具有广泛宿主的高致病性病原菌.本研究分离得到的DGZ5菌株对大黄鱼的LD50为8.07×106cfu·mL-1，严良[13]分离得到的LQJ06菌株对斑马鱼的LD50为2.98×106cfu·尾-1，乔迁等[28]分离得到的BY0081菌株对剑尾鱼的LD50为2.82×105cfu·g-1，均表明杀香鱼假单胞菌对鱼类具有较强的致病性，感染后的鱼类通常表现为嗜睡、食欲不振、定向障碍、腹部肿胀、腹水严重、脾脏组织表面覆盖大量白斑等多种症状.患病鱼类的肝脏和肾脏发生明显的组织病理变化.如：Sun et al[29]发现，感染杀香鱼假单胞菌的澳洲肺鱼肾脏肾小球缩小甚至塌陷，鲍曼囊间距增大，肝脏脂肪变性、坏死；陈卓等[12]发现，杀香鱼假单胞菌感染后会破坏大黄鱼内脏组织，内脏组织的损害程度与杀香鱼假单胞菌的分布有关.本研究中，DGZ5菌株感染后，在大黄鱼肝脏和肾脏发现典型的“白点”，内脏发生了显著的组织病理学变化，此结果与Luo et al[30]的研究结果一致.

DGZ5菌株对所测试的36种抗生素药物具有不同程度的敏感性，对青霉素、阿莫西林和氨苄西林等18种抗生素药物耐药，对头孢他啶、庆大霉素、丁胺卡那、新霉素和卡那霉素等12种抗生素药物高度敏感，DGZ5菌株对抗生素的敏感性与严良[13]分离得到的LQJ06菌株大致相同，只是DGZ5菌株对氯霉素敏感，而LQJ06菌株则耐药.游宇[31]对福建大黄鱼内脏白点病病原菌的耐药性状况进行了分析，葛明峰等[32]也对宁波市大黄鱼细菌性病原菌的药敏特性进行检测.病原菌耐药性监测对科学精准用药，推动水产绿色健康养殖及用药减量具有十分重要的意义.目前，联合国粮农组织(FAO)渔业委员会禁止氯霉素、克林霉素和四环素等药物用于鱼病防治，这提示养殖户和生产人员在大黄鱼养殖的过程中，要在国家允许的药物使用范围内，选取敏感药物用于病害防治.