固定化脂肪酶的条件优化及对猪肉风味的影响

陈瑞琦，韩金承，吴慎威，赵丽莹，代媛媛，孟鑫

锦州医科大学食品与健康学院（锦州 121000）

近年来，风味酶被广泛应用于乳制品、肉制品和葡萄酒中，受到国内外学者的广泛关注。如林伟锋等[1]研究发现脂肪酶抑制乳酸菌增殖和产酸，但明显促进羧酸类生成，并产生酯类，可明显改变风味，赋予体系丰富的风味。前期从猪肉中提取内源性脂肪酶，对鸡肉、猪肉等肉品风味有明显的改善作用，并在大肠杆菌、酿酒酵母中分别表达脂肪酶基因，发现重组酶对典型肉类及奶制品的风味有一定影响[2-5]。

然而，在生产加工过程中，由于受到环境条件的制约，脂肪酶容易失活，且难以重复使用，造成资源浪费，限制了大规模生产应用。为此，选择适宜的固定化方法对脂肪酶进行改造，生产固定化脂肪酶，是解决该问题的有效途径。固定化酶多采用吸附法、共价交联法、包埋法等方法，但固定化材料多为化学试剂，不利于脂肪酶在风味食品、油脂加工生产中应用[6]。核桃壳是环保型的天然生物材料，来源丰富、无毒无污染，可通过吸附进行酶的固定化，把脂肪酶吸附到活性炭孔隙上，产物的使用安全性比较容易有保证[7]。与游离脂肪酶相比，固定化脂肪酶在保持其高效专一及温和的酶催化反应特异性的同时又克服了游离酶的不足之处，呈现贮存稳定性高、分离易回收、可多次重复使用、操作连续可控、工艺简便等一系列优点[8]。

为此，试验以改性核桃壳作为固定化猪肉内源性脂肪酶的载体，通过载体表面和酶分子表面间的吸附而达到固定目的，结合单因素试验和响应面优化试验优化固定化脂肪酶制备工艺，并以猪肉为例，采用 HSSPME-GC-MS考察经猪肉内源性脂肪酶固定化前后猪肉风味的变化，以期为肉制品深加工提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

猪肉、生核桃壳（购买于锦州大润发）；其他试剂（均为市售分析纯）。

RE-2000A马弗炉（沈阳市长虹工业电器厂）；固相微萃取（德国达姆施塔特默克集团）；GL570气相色谱-质谱联用仪（武汉国量仪器有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 猪肉内源性脂肪酶的提取

采用双水相法从猪肉（肥肉）中提取脂肪酶酶液，参考杨爽等[4]提取方法并做简单修改。萃取条件：PEG2000浓度32%，(NH4)2SO4浓度32%，pH 6.5。

1.2.2 改性核桃壳固定化猪肉内源性脂肪酶

1.2.2.1 载体工艺制备

参考韩本勇等[9]的方法稍加修改。将核桃壳经高温烘干、粉碎，取10 g核桃壳烘干粉末加50 mL磷酸溶液，在60 ℃水浴锅中进行加热将其浸渍15 min，过滤将其放置加热到高温送入马弗炉，在300 ℃高温条件下炭化90 min，在600 ℃高温条件下活化90 min，活化工作完成后，用0.1%盐酸清洗并用蒸馏水将其洗涤至中性，放置于高温烘干箱烘干，保存备用。

1.2.2.2 载体的表面氧化

取5 g载体，加入50 mL 20%硝酸溶液，在80 ℃水浴锅中进行浸泡3 h。过滤后，加入去离子水煮沸，过滤，干燥4次。

1.2.2.3 载体的表面硅烷化

取1 g氧化后的载体于100 mL无水乙醇中，超声分散1 h后，加入一定量的0.01 mol/L盐酸，调节至pH 4.0，加入3%的KH-570溶液，于60 ℃水浴反应24 h，过滤，滤饼分别用无水乙醇和蒸馏水洗涤，除去未反应的KH-570，烘干。

1.2.2.4 固定化酶的制备

取1.0 g改性的载体于三角瓶中，加入5 mL瓶中含有50 mg/mL脂肪酶酶液，在摇床上持续振荡一定时间，使这些载体能够迅速吸附固定脂肪酶。经抽滤、去离子水洗涤、冷冻干燥得到固定化脂肪酶。

1.2.3 固定化脂肪酶酶活性测定方法

试验采用一种经过不断改进的铜皂法对酶进行活性测定，在2支试管中依次继续加入2 mL橄榄油乳化液和2.5 mL 0.05 mol/L磷酸缓冲液（pH 7.5），在40 ℃水浴中加热5 min后，加入0.5 mL脂肪酶液，充分均匀振荡混匀后，水浴中振荡15 min，立即加入1 mL 6 mol/L盐酸溶液，6 mL 95%乙醇溶液，混合后继续加入3 mL异辛烷，并完全均匀振荡90 s。于60 ℃静止放置10 min，待冷却后，取上层1 mL异辛烷，将其放入1支新试管中，依次分别加入4 mL异辛烷和1 mL铜盐显色剂，混匀后滤液进行低温静置，取上清液，用紫外可见分光光度计在714 nm波长下进行测定其中的吸光度，根据标准曲线得到脂肪酶酶活力[10]。酶活力单位（U）：1 μmol脂肪酸在1 min内由酶转化而形成的活力的量称为1个脂肪酶活力单位。

1.2.4 单因素试验

以载体量（0.50，0.75，1.00，1.25和1.50 g）、pH（6.0，7.0和8.0）、固定化温度（35，40，45，50和55 ℃）和固定化时间（1，2，3，4和5 h）为单因素，相对酶活为考察指标，考察4个因素对固定化酶活性的影响。每个样品重复试验3次。

1.2.5 正交试验

在单因素试验基础上，选取载体量、pH浓度、固定化温度和固定化时间作为考察因素，以相对酶活为响应值，采用四因素三水平进行响应面分析优化，每个样品重复试验3次，具体试验设计见表1。

表1 响应面试验因素水平设计

1.2.6 风味检测

1.2.6.1 原料肉的处理

在常温，pH 6.5条件下，称取10 mL蒸馏水与25 g猪肉样品充分混匀浸泡30 min（样品A）；分别取10 mL游离酶酶液和固定化酶酶液与25 g猪肉样品充分混匀浸泡30 min（样品B和样品C）。每组分别置于300 mL沸水中单独煮制2 min备用[11]。

1.2.6.2 HS-SPME-GC-MS分析

固相微萃取：3组样品分别取4 g切碎，煮熟后迅速放入20 mL顶空瓶中，快速加盖进行GC-MS检测，每组样品平行试验2次。加入4 mL饱和氯化钠溶液及磁转子，用聚四氟乙烯隔垫密封，在磁搅拌器中45 ℃加热10 min。用活化的萃取头（270 ℃活化60 min）顶空吸附35 min后，然后将萃取头插入进样口解吸5 min。每个样品重复试验3次[11]，样品分别标记为样品A，B和C。

气相色谱条件：HP-5MS毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；进样口温度250 ℃，不分流模式进样；载气He，流速1.0 mL/min；程序升温，柱初温40℃，保持3 min，以3 ℃/min升至100 ℃，以5 ℃/min升至230 ℃，保持5 min[11]。

质谱条件：色谱-质谱接口温度280 ℃，离子源温度230 ℃，四极杆温度150 ℃；离子化方式EI；电子能量70 eV；质量扫描范围m/z30～550[11]。

1.3 数据处理

所有结果均为3次重复的平均值，使用Microsoft Office 2013软件绘制图。响应面数据采用Design-Expert 8.0.5软件进行分析。GC-MS数据采用挥发性成分通过谱库检索进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 载体量对固定化效果的影响

在pH 7.0、固定化温度40 ℃、固定化时间2 h条件下，载体量范围设置为0.5～1.5 g，考察不同载体量对固定化脂肪酶酶活的影响。结果如图1（A）所示，随着载体量增加，固定化酶相对酶活呈现先上升后下降趋势。研究表明，改性核桃壳粉末通过吸附法能把脂肪酶固定化，载体量过高或过低均会对固定化效果产生影响。载体量0.75 g时酶活最佳。

图1 各因素对固定化脂肪酶的影响

2.1.2 pH对固定化效果的影响

在载体量0.75 g、固定化温度40 ℃、固定化时间2 h条件下，pH范围设置为6.0～8.0，考察不同pH对固定化酶酶活的影响。结果如图1（B）所示，pH 7.0时，固定化脂肪酶的相对酶活力最高。研究表明，酶促反应对酸碱度很敏感，pH影响酶分子构象稳定性，过酸或过碱均可导致酶的变性失活。如pH偏离最适pH，则酶催化能力下降。因此，在设置范围内使酶活性表现最高的pH 7.0为最适pH。

2.1.3 温度对固定化效果的影响

在载体量0.75 g、pH 7.0、固定化时间2 h条件下，固定化温度范围设置为35～55 ℃，考察不同固定化温度对固定化酶酶活的影响。结果如图1（C）所示，在所设置的固定化温度范围中，相对酶活大致呈现先升后降趋势，在45 ℃达到最佳酶活。研究表明在最适温度下，温度升高，相对酶活升高。在最适温度上，随着温度升高，酶的变形程度逐步加大，酶的活力逐步降低。因此，45 ℃时酶相对活力最大，为最适温度。

2.1.4 时间对固定化效果的影响

在载体量0.75 g、pH 7.0、固定化温度45 ℃条件下，固定化时间范围设置为1～5 h，考察不同固定化时间对固定化酶酶活的影响。结果图1（D）所示，在设置的固定化时间范围内，相对酶活呈现先升高后降低趋势，在0～3 h，改性核桃壳粉末与脂肪酶在充分振荡的条件下，能更好地吸附脂肪酶，使固定化的效果增强，固定化时间大于3 h时，过度反应导致改性核桃壳活性炭孔隙过于致密，阻止载体与酶分子的接触，使得酶活降低。因此最佳固定化时间为3 h。

2.2 响应面优化结果

2.2.1 回归模型建立与讨论

根据单因素试验，以相对酶活为响应值，每个影响因素择出3个水平，即A载体量（0.50，0.75和1.00 g）、B pH（6，7和8）、C温度（40，45和50℃）、D时间（2，3和4 h），设计响应面试验，经Box-Behnken分析得出结果，见表3。

使用Design-Expert 8.0.5软件对表2进行二次线性回归拟合，得到回归方程Y=-1 387.129 67+660.148 67A+174.729 50B+26.807 80C+15.363 00D+5.320 00AB+0.066 000AC+1.270 00AD+0.166 50BC+0.602 50BD+0.183 50CD-491.001 33A2-13.290 08B2-0.315 05C2-4.663 8D2。

表2 响应面分析结果

由表3方差分析的结果可以得知：整体模型F=187.37，P＜0.000 1，表明试验的模型极显著；失拟项P=0.079 8＞0.05，说明模型失拟度不显著；模型的决定系数R2=0.971 2，试验值与预测值非常接近，其线性关系和二次关系极显著（P＜0.000 1），说明该模型可很好地解释响应值。模型的调整决定系数Radj2=0.989 4，说明该模型能解释响应值的变化，因而拟合程度较好，试验误差小，可用此模型优化酶活进行分析和预测。一次项A（P＜0.01）差异极显著，一次项B和C（P＜0.05）差异显著，一次项D（P＞0.05）差异不显著；A2、B2、C2、D2（P＜0.01）差异极显著。由F值得出，影响酶活优化的4个因素的主次顺序为A＞B＞C＞D，即载体量＞pH＞固定化温度＞固定化时间，可见，载体量影响最大，其次为固定化环境pH，固定化时间影响最小。

表3 响应面试验方差分析

2.3 HS-SPME-GC-MS分析猪肉风味

通过HS-SPM-GC-MS方法，测定出A、B、C这3组样品的挥发性物质分别为54，44和44种，主要为醛类、醇类和烃类等（图2），从挥发性物质含量方面来看，经固定化脂肪酶处理的样品这类含量更丰富，对样品进行处理后能赋予猪肉更丰富的香味[12]。

图2 猪肉样品处理前后挥发性成分相对含量的比较

2.3.1 醛类物质分析

猪肉中的挥发性物质类型十分丰富，醛类便是其中的一种，这类物质通常是脂肪酸氧化降解后形成的。试验结果表明，在对3组猪肉样品进行检测后，均得到9种醛类物质，其含量占比依次是48.89%，51.33%和54.32%。有研究报道生猪肉中醛类化合物含量约50.27%[13]。样品C中醛类物质含量高于文献报道，由此可见，在对猪肉样本进行处理过后，会形成更多醛类物质。而醛类因为觉察阈值较低，所以会对肉品风味产生较大影响，通常当脂肪酸出现氧化降解反应后会生成此类物质。3组样品中都存在的醛类是5～9个碳原子直链醛，为主要的醛类，其中，具备较高百分含量的包括己醛、壬醛等[14]。其中，含量最高的是己醛，其味道和青草香味差不多，对猪肉风味的影响较大，其后是庚醛、辛醛等，有果香味或油脂香，也是猪肉风味的重要影响因素，相似的研究成果也可见报道[15]。

2.3.2 烃类和酯类物质分析

烯烃族一般来自于饱和脂肪酸烷氧自由基的均裂，其感觉阈值范围通常较高，对肉类风味的直观贡献并不大，甚至基本不影响香味[16]。A、B、C这3组样品中烯烃类分别检出5，3和3种，相对含量分别为2.43%，4.61%和36.83%，能够发现它们之间存在较大区别。酯类物质一般来源于酸与醇间进行的酯化反应。样品中，在检验出酯类化合物的数量、相对含量方面，A组分别为5种（3.20%），B组分别为3种（3.26%），C组分别为3种（5.72%）。经分析可知，酯类化合物能够为食物提供的气味主要有3种，首先是蜂蜜香，其次是花香，最后是水果香。在需要对猪肉风味进行丰富之时，它也能起到一定作用[17]。

2.3.3 醇类物质分析

在丰富肉类风味方面，醇类虽不如醛类的贡献更大，但在肉品风味中也起关键性作用。在3组样品里，在检验出醇类物质的数量、相对含量方面，A组分别为5种（5.02%），B组分别为7种（18.43%），C组分别为7种（23.99%）。1-辛烯-3-醇能产生蘑菇香味，可以提高肉的鲜味，为最典型的肉香型物质，来源于脂质β-氧化[18]，其相对含量依次是1.23%，13.38%和18.52%，其在A组中含量最低。二甲基硅烷二醇、正辛醇、4, 7-二甲基-4-辛醇在B、C组中都比A组多。由不饱和脂肪酸可知，当其出现氧化裂解反应之时，会有醇类、醛类物质形成[19]。此外，常认为肉品风味并不会受到酸类物质的较大影响，试验中检测出的酸类化合物含量并不高，相对含量分别为0.51%，0.20%和0.26%。同时在部分挥发性风味物质中，酸类扮演着中间体的角色，但普遍认为此类物质并不会对猪肉风味产生直接性影响。

2.3.4 酮类物质分析

猪肉中的不饱和脂肪酸，发生氧化降解反应时会生成酮类物质。经分析可知，一部分酮类物质的气味是花果香，而二酮通常产生奶油香、肉香，在碳链数量变多时，花香会更为浓郁[20]。在上述样品里，在检验出酮类物质的数量、相对含量方面，A组分别为3种（11.25%），B组分别为2种（7.99%），C组分别为2种（3.89%）。其中有一类酮类物质是上述样品都有的，为3-辛酮，其散发着奶油香，当亚油酸发生脂氧合酶氧化反应之时，便会生成这类物质[20]。蔡原等[21]发现在对猪肉风味的贡献方面，酮类远不及醛类，然而在肉类整体风味中，酮类所起到的影响却不可忽略。

2.3.5 其他物质分析

当含硫氨基酸发生降解反应时，易生成含硫物质，检测的含硫物质有许多，比如N-（二甲基氨基甲基）氮丙啶、二甲基二硫化物等。在这些含硫物质中，带有浓郁肉香味的二甲基二硫化物虽然并不具备较高的含量，却能够对猪肉风味产生极大影响。同时，通常肉类特征香味的来源有许多，杂环类化合物便是其中的一种[22]。像检测出的十二甲基环六硅氧烷等，尽管并不具备较高含量，但其对猪肉风味的影响也不可忽略，有研究发现，在肉的风味上，这些物质扮演主要中间体的角色，对肉香的形成作出贡献极大。

3 结论

试验以改性核桃壳为载体，采用吸附法固定化猪肉内源性脂肪酶。通过单因素试验及响应面优化固定化脂肪酶的工艺条件，并研究固定化脂肪酶的热稳定和重复使用性。在载体量0.75 g、pH 7.0、固定化温度45 ℃、时间3 h条件下，试验制备的固定化脂肪酶最高酶活力可达178 U/g。

采用HS-SPME-GC-MS技术研究猪肉中具体的挥发性风味物质成分，研究结果表明：经改性核桃壳固定化脂肪酶处理前后的猪肉样品中有9种醛类物质，其含量分别为48.89%，51.33%和54.32%；其次是醇类中分别检出5，7和7种，相对含量分别为5.02%，18.43%和23.99%，其中主要的醇类化合物是1-辛烯-3-醇；烯烃类分别检出5，3和3 种，相对含量分别为2.43%，4.61%和36.83%。添加改性核桃壳固定化猪肉内源性脂肪酶后肉品风味物质成分发生改变，猪肉样品的挥发性物质分别为54，44和44种，主要为醛类、醇类和烃类，这些挥发性风味物质的成分变化表明，添加改性核桃壳法固定化的猪肉内源性脂肪酶处理肉品可以有效增加肉品的香气，提高肉品风味，并为固定化脂肪酶在肉品中的应用提供试验依据。