硬化蛋白对骨代谢作用机制的研究

贺焱 杜娟 胡晨琳 杨玲 刘艳群 黄昶荃

1.川北医学院临床医学系，四川 南充 637000

2.绵阳市第三人民医院·四川省精神卫生中心，四川 绵阳 621000

3.重庆医科大学附属第一医院，重庆 400016

骨骼系统通过骨重建的方式维持其骨量及生理结构的相对稳定，一旦骨重建失衡则易导致骨质疏松(osteoporosis，OP)。硬化蛋白被认为具有负向调节骨重建的作用，在骨质疏松的进程中发挥重要作用。硬化蛋白单克隆抗体(Scl-Ab)的出现在治疗骨质疏松上向前迈出了一大步，在已经完成的几项大型临床试验中证明了罗莫单抗(Romosozumab，ROMO)在目前常用的抗骨质疏松药物中具有更好的作用。ARCH试验发现在具有高骨折风险的绝经后骨质疏松女性中，ROMO治疗12个月继以阿仑膦酸钠治疗后发生骨折的风险显著低于单独使用阿仑膦酸钠[1]。FRAME临床试验比较了ROMO与特立帕肽对接受双膦酸盐治疗后的绝经后骨质疏松症妇女骨密度的影响，发现ROMO能促进髋骨骨密度增加，而在特立帕肽中未观察到[2]。但由于对硬化蛋白认识不足，硬化蛋白抗体的研究受限，同时对其不良反应还存在担忧[3-4]，因此硬化蛋白还有深入研究的价值与突破空间，本文将对硬化蛋白及其对骨代谢的作用机制进展作一综述。

1 硬化蛋白

1.1 硬化蛋白的结构与来源

硬化蛋白是SOST基因表达的一种含190个氨基酸的分泌型糖蛋白[3]，主要在骨骼系统中表达，通过阻断典型Wnt/β-catenin信号通路(Canonical Wnt/β-catenin pathway)发挥作用。硬化蛋白是胱氨酸结家族的一个非典型成员，它包含其他家族成员中不存在的长而灵活的N和C末端，剩余的残基形成3个环状结构，环1和环3中的残基形成两对扭曲的反向平行β链并在其尖端通过单个二硫键连接，在其凸面存在与其他蛋白质的结合位点[5]。环2具有多种构象，是结合低密度脂蛋白受体相关蛋白5/6(LRP5/6)的关键区域[6]。

硬化蛋白主要作用于骨骼系统，骨细胞是其主要来源[7]。之后在其他系统中也发现了Sost mRNA并发挥生理或病理作用，如促进血管钙化[8]、调节B细胞的发育和分化[9]等。

1.2 硬化蛋白表达的调节

最初，硬化蛋白是在对硬化症(Sclerosteosis)和范布赫姆病(Van Buchem disease)的研究中发现的，在这两种疾病中均发现SOST基因编码的硬化蛋白的突变，且都表现为高骨量疾病[10]。硬化症由SOST基因突变导致，而在范布赫姆病中，在该基因内没有发现致病突变，但在其染色体17q12上有52kb缺失，影响了SOST基因的转录[11]。进一步研究发现SOST表达所必需的增强子元件、进化保守区5(ECR5)以及肌细胞增强因子2(Mef2c)对SOST转录活性的调节，Mef2c通过与ECR5结合调节SOST转录[12]。另外，DNA甲基化调节SOST的表达，Reppe等[13]在OP中观察到SOST启动子甲基化增加，降低了血清硬化蛋白浓度降低并减少了对Wnt信号传导的抑制，进一步促进骨形成。硬化蛋白对骨代谢的作用备受重视，但对调节其表达机制的了解还很少。

2 经典Wnt/β-catenin信号通路：硬化蛋白的主要作用通路

经典Wnt/β-catenin信号通路是硬化蛋白作用的主要通路[3]。当细胞外Wnt配体与跨膜受体(Frizzled)、低密度脂蛋白受体相关蛋白5/6(LRP5/6)形成三元复合物，将导致破坏复合物移位到细胞膜[14]。破坏复合物是轴蛋白(Axin)、酪蛋白激酶1(CK1)、腺瘤性息肉病大肠杆菌(APC)以及糖原合酶激酶3(GSK3)组成的复合物，可以使LRP5/6胞内区域磷酸化，募集轴蛋白(Axin)，破坏破坏复合物的活性，进而导致非磷酸化的β-catenin聚集在细胞质中，并转位到细胞核作为转录因子T细胞因子(Tcf)和淋巴因子结合因子(LEF)的激活因子发挥作用，启动Wnt靶基因的转录[15]。在硬化蛋白抑制状态下，硬化蛋白与LRP5/6细胞表面受体结合，阻止Wnt配体与LRP5/6相互作用，将抑制典型的Wnt信号转导。细胞质中的β-catenin被磷酸化并被破坏复合物靶向泛素化，在蛋白酶体中被降解[14]。

硬化蛋白还可以通过非经典Wnt/β-catenin信号通路发挥作用。在软骨细胞中，Wnt3a可激活c-JunN末端激酶(JNK)和PKC，用硬化蛋白处理仅抑制磷酸化JNK，表明硬化蛋白可通过非经典c-JunN末端激酶(JNK)信号通路发挥作用[16]。针对不同Wnt配体，硬化蛋白可能还存在其特有通路。

在经典Wnt/β-catenin信号中，LRP5/6与低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP4)发挥着重要作用，对Wnt信号转导必不可少。LRP5和LRP6具有高度同源性并在机体组织中广泛表达，它们在介导Wnt信号传导方面具有相似的功能。LRP4与LRP5/6结构相似，但在硬化蛋白中发挥着不同的作用。

2.1 LRP5/LRP6

LRP5和LRP6为单程跨膜蛋白，存在于细胞表面，其胞外区由4个重复单元(从N到C末端命名为E1到E4)组成，每个重复单元都有一个YWTDLDL-螺旋域和一个表皮生长因子样域。Bourhis等[17]研究发现 E1结合硬化蛋白中的短肽，因此LRP5/6 E1可作为药物研制的靶点。Kim等[18]发现硬化蛋白的C端与LRP6 E2之间存在结合位点，并能增加SOST与LRP6亲和力，但其作用不如SOST环2-LRP6 E1广泛。因此针对环2和C端肽的抗体治疗效果可能更好、不良反应更少，是药物研发的另一种选择。Sebastian等[19]通过测序技术来鉴定成骨细胞中受Wnt3a调控的靶基因，发现与LRP6相比，LRP5的缺失对Wnt3a信号传导的影响很小。Choi等[20]通过使用含有喹喔啉的BMD4503-2与LRP5/6-硬化蛋白复合物的竞争性结合，恢复了Wnt/β-连环蛋白信号通路的下调活性。因此，未来可基于结构设计开发针对LRP5/6-硬化蛋白相互作用的小分子抑制剂。

2.2 LRP4

最初研究发现，LRP4的第3个螺旋桨结构域(E3)中发生了两个产生类硬化症的人类错义突变[21]，因此提出LRP4可能促进硬化蛋白对Wnt信号的抑制作用。Fijalkowski等[22]在因LRP4突变而患有硬化症的患者中发现血清硬化蛋白水平升高，因此推测硬化蛋白分泌后在LRP4的作用下保留在骨骼中发挥作用。Bullock等[21]进一步研究发现携带LRP4-R1170W错义突变的小鼠产生高骨量表型，并且对硬化蛋白水平的改变不太敏感。LRP4可作为药物研究的靶点，其与硬化蛋白作用的具体机制有待进一步研究。

3 硬化蛋白在骨骼系统中的作用

3.1 破骨细胞

已知RANKL/OPG比值是破骨细胞形成的关键因素并影响其活性，硬化蛋白可通过影响RANKL间接促进骨吸收[23]。而缺乏β-catenin的成骨细胞表现出成熟和矿化受损、RANKL表达增加及OPG表达减弱[3]。一直认为破骨细胞不表达Wnt受体，硬化蛋白通过作用于成骨细胞Wnt通路影响RANKL进一步作用于破骨细胞，但相关实验未能排除其他通路对β-catenin的影响，并且目前所有研究均未表明成骨细胞Wnt通路如何影响RANKL。Weivoda等[24]进一步发现破骨细胞可表达经典的Wnt受体，Wnt3a直接通过破骨细胞前体中的经典(β-catenin)和非经典(cAMP/PKA)途径抑制破骨细胞分化。

3.2 成骨细胞

成骨细胞起源于骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSC)，在Wnt/β-catenin信号和转录因子(如Runx2和Osterix)的特异性激活下，骨祖细胞向成骨细胞方向分化[3]，产生并矿化骨基质，部分成骨细胞作为骨细胞嵌入钙化基质中。硬化蛋白作为骨形成抑制剂的作用贯穿于成骨细胞谱系：抑制骨祖细胞的增殖，影响成骨前体细胞的增殖和募集，抑制成骨细胞的成熟和分化，负调控成骨细胞的活性。在老年卵巢切除大鼠中发现Scl-Ab可以促进骨祖细胞增殖并减少凋亡[25]，Scl-Ab还能增加成骨细胞前体的数量并促进其分化为成熟成骨细胞[26]，同时增加I型前胶原氨基末端前肽(P1NP)、骨特异性碱性磷酸酶(BSAP)和骨钙素等骨形成标记物[27]。另外，Thouverey等[28]发现硬化蛋白还可以通过激活血小板衍生生长因子受体(PDGFR)及其下游信号通路抑制成骨细胞分化。在人类成骨细胞中，硬化蛋白通过激活caspase1、3、4和7以及增加促凋亡因子bax的表达来诱导细胞凋亡[3]。

硬化蛋白还具有维持骨衬里细胞(bone lining cell，BLC)静止状态的作用，骨衬里细胞相当于成骨细胞储备池，使用Scl-Ab治疗后，小鼠BLC在骨膜和皮质内表面迅速转变为活跃的成骨细胞[29]。但是目前对于骨衬里细胞的研究还比较少，关于其作用机制还有待进一步研究，或许可为促进成骨作用提供新途径。

3.3 骨髓脂肪组织

与成骨细胞一样，骨髓脂肪组织(BMAT)也起源于BMMSC，因此 BMMSC分化为成骨细胞与脂肪细胞之间存在竞争性。SOST可通过抑制前脂肪细胞中的Wnt信号诱导脂肪生成[30]，而Scl-Ab可以恢复在去卵巢兔的骨髓脂肪扩张[31]。另外，Abdallah等[32]发现骨髓脂肪细胞可以通过脂肪因子诱导NF-κB途径激活的机制阻断BMPs信号传导，从而对BMMSC的成骨细胞分化发挥抑制作用，但目前没有证据证明硬化蛋白对此过程有无影响。骨髓脂肪细胞对骨代谢的影响备受关注，但至今无重大进展，硬化蛋白可能是潜在突破点。

3.4 调节骨结构、骨量与骨强度

硬化蛋白是骨形成、骨量和骨强度的负向调节剂，Scl-Ab可拮抗这种作用，Scl-Ab还可以使骨折愈合过程中骨痂质量与强度增加[30]。硬化蛋白还可以影响骨骼微结构，Scl-Ab可以消除卵巢切除术导致的皮质骨中骨细胞形态和结构异常[33]以及改善雄性食蟹猴骨小梁微结构[34]。Albiol等[35]研究发现硬化蛋白缺乏症导致雄性和雌性小鼠的小梁骨形成增加，但仅导致雌性的小梁骨吸收减少，关于硬化蛋白对骨骼作用的性别差异还在进一步研究中。

4 硬化蛋白单克隆抗体

硬化蛋白单克隆抗体是目前唯一一个兼具促进骨形成与抑制骨吸收双重作用的骨质疏松治疗药物。如前所述，许多动物以及临床试验[10,36]均表明Scl-Ab治疗可增加骨形成并降低骨吸收。但也存在许多问题，硬化蛋白抗体的作用呈现出时间依赖性，并且在不同骨组织衰减时间存在差异[37-38]，但其机制还不明确。另外，反复使用硬化蛋白抗体，骨形成反应的减弱可能与Wnt拮抗剂(Dkk1、SFRP4、Bglap、Postn和WISP1)的上调有关[39]。关于ROMO临床试验中发现的不良事件，特别是ROMO使用者的心血管风险[40]，是目前最令人担忧的问题，一项关于Romosozumab随机临床试验的荟萃分析表明，Romosozumab 的心血管事件风险可能更高[41]，因此针对硬化蛋白抗体的研发还有很大潜力与发展空间。

5 小结与展望

一直以来，抗骨吸收药物占据抗骨质疏松药物的主要市场，研发促进骨形成的药物是一大趋势。目前硬化蛋白对骨骼系统的作用机制研究已取得重大进展，但由于其不良反应，临床应用受到限制，因此，目前在着力于开发新型促骨形成药物的同时，优化硬化蛋白抗体，研制出不良反应更小，疗效更佳的硬化蛋白抗体也是有潜力的方向。硬化蛋白对成骨细胞与破骨细胞的作用研究已经比较成熟，但关于硬化蛋白的体内调节机制以及其对骨髓脂肪细胞的作用机制研究还存在突破空间。另外，为进一步明确硬化蛋白抗体的不良反应，能更好地指导ROMO的临床应用，硬化蛋白对骨骼外系统的作用以及机制仍需深入研究。