部分骨形态蛋白调节骨再生的临床研究进展

李娜 卢雪玲 娜迪拉

新疆医科大学第二附属医院内分泌科，新疆 乌鲁木齐 830000

骨形态蛋白(bone morphoprotein，BMPs)是多功能生长因子，它属于转化生长因子-β(TGF-β)超家族，已有近20种BMPs成员被发现，它们具有不同程度促进成骨干细胞分化的能力，成骨干细胞分化是骨组织损伤修复与再生过程的生理基础。因此如何精准、高效地调控骨干细胞的定向分化，实现人骨组织的修复与再生，是目前基础研究和临床研究的热点与难点问题。本文将通过对骨形态蛋白-2、骨形态蛋白-4、骨形态蛋白-6、骨形态蛋白-7、骨形态蛋白-9在促进骨再生的临床研究进展上分别进行阐述。

1 骨形态蛋白-2的临床研究进展

骨形态蛋白-2(bone morphoprotein-2，BMP-2)是第一个被描述的BMPs，BMP-2的一些特定功能包括手指形成和激活成骨基因。由于其多样化的功能和成骨潜力，美国食品药品监督管理局批准重组人BMP-2 (rhBMP-2)用于脊柱融合手术、胫骨干修复和上颌窦重建手术。然而，在首次注射rhBMP-2后不久，就出现了一些不良并发症，血肿形成，骨溶解、增加自发性骨折、冠状动脉疾病、近视和其他并发症[1]。这是由于BMP-2在初始暴发释放，导致组织过度肿胀，再加上骨重塑阶段的生理性炎症期。为了应对这些挑战，已有报道使用海藻酸盐、壳聚糖[2]、胶原[3]、纳米颗粒[4]、阿仑膦酸盐和肝素[5]对双相磷酸钙(biphasic calcium phosphate，BCP)进行表面改性，以防止初始爆发释放，并允许BMP-2的长时间释放，但很少有研究实现了在一定时期内阻断释放。因此，有必要制作一种理想的骨基质，能够克服BMP-2传递的局限性，研究人员假设了BCP上的涂层多层膜通过减少BMP-2的初始释放，并在骨重建过程中维持BMP-2的释放，这些策略是将BCP和BMP-2之间的高亲和力对释放的抑制降到最低，并以能够与BMP-2结合的替代物修饰BCP表面[3]，以期能制备的BCP通过多层膜程序化释放BMP-2[6]。

2 骨形态蛋白-4的临床研究进展

骨形态蛋白-4(bone morphoprotein-4，BMP-4)作为已知的可促进骨生成的生长因子，也可以作为抗骨质疏松的作用靶点，BMP-4在促进骨再生能力比BMP-2更弱一些[7]。为了克服这些障碍，研究人员通过药物调控BMP-4的转录表达过程促进成骨作用[8]，中医学主张“肾藏精主骨生髓”[9]，许多中药都具有促进成骨的功效。小檗碱可以通过增强BMP-4诱导的碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性和ALP启动子的转录，但是低效力和低生物利用度限制了该药物的临床开发。Han等[10]先前合成了一种化合物Q8，该化合物是小檗碱的结构同系物，同时，Q8也可以抑制了PPARγ(PPARγ是一种已知的骨形成负调控因子)的表达和活性，进而增加了核中β-catenin的表达，并最终促进了成骨细胞分化。还有一些例如淫羊藿苷[11]、杜仲[12]等，都具有促进成骨的功效。Shiozaki等[13]研究将BMP-4与纤维连接蛋白衍生的纳米载体——胶原结合域(collagen-binding domain，CBD)融合。检测了CBD-BMP-4融合蛋白的稳定性及成骨能力，并分别对照了是否使用海绵支架。结果表明纳米载体-CBD增强了BMP-4在骨中的保留，结果表明在缺乏支架的情况，CBD-BMP-4诱导的骨形成比单独BMP-4、单独CBD更好。

此外，除了促进骨再生，BMP-4还具有调节全身胰岛素敏感性和肝糖脂代谢、脂肪细胞褐变和全身能量平衡方面具有治疗潜力。且动物实验结果证明长期使用BMP4治疗没有重大不良反应的报道。BMP-4在调节全身葡萄糖稳态和胰岛素抵抗方面发挥重要作用，它对肝糖的产生和脂质代谢也有重要的抑制作用[14]，因此BMP-4靶向治疗可能对于糖尿病相关的代谢性骨病人群更为有益。Krouwels等[15]通过动物研究比较了BMP-2、BMP-4、BMP-6和BMP-7及他们的组合和异二聚体对人髓核(nucleus pulposus，NP)细胞的再生作用，认为BMP-4对于椎间盘再生潜力更为突出。

3 骨形态蛋白-6的临床研究进展

BMPs已显示出增强间充质细胞(mesenchymal cells，MCs)的成骨分化并促进骨形成。已知骨形态蛋白-6(bone morphoprotein-6，BMP-6)凭借其骨诱导和细胞类型特异性增殖活性，在MCs向成骨分化的过程中起重要作用。然而，与BMP-6骨诱导活性有关的分子机制仍不清楚，并且仍需进一步研究。Msx2是转录因子同源框基因家族的成员，促进钙化。因此，为了知道它是否也可能在BMP-6诱导的成骨中发挥作用，研究人员用BMP-6、腺病毒-msx2 (Ad-Msx2)或腺病毒-simsx2 (Ad-siMsx2)处理两种小鼠间充质细胞系，mRNA和蛋白表达结果表明BMP-6可以增强Msx2的表达并激活Smad 1/5/8、p38和ERK1/2的磷酸化。被Ad-Msx2转染后，显着促进了BMP-6诱导的磷酸化激活。转染Ad-Msx2后，Mesenchymal cells诱导的磷酸化激活明显增强。相反，被 Ad-siMsx2转染的两个细胞系即使在被BMP-6诱导后也呈现出三种磷酸化蛋白的抑制表达[16]。这些发现为理解BMP-6诱导成骨机制提供了新的观点，并为骨缺损的治疗提供了靶点。

有先前的体外研究表明，在保留生物活性的前提下，BMP-6释放时间可达30 d。因此BMP-6的持续释放对小鼠胚胎成骨细胞前体细胞的成骨分化具有较好的作用，生物分子载体结构由于其在骨组织工程领域的潜在应用而引起广泛关注，Toprak等[17]开发了用于控制BMP-6的受控释放的MOF嵌入式电纺纤维支架，结果证明电纺支架中嵌入mof载体可作为骨组织工程应用中骨再生的有效平台。

此外，BMP-6对维持葡萄糖稳态发挥重要作用，Pauk等[18]用BMP-6治疗小鼠6 d，然后对其胰岛素释放、体重、脂质指标和糖耐量进行分析，发现循环血糖和血脂水平降低，随后血浆胰岛素水平显著升高，呈剂量依赖性。此外，在糖耐量试验中，BMP-6改善了葡萄糖波动，降低了21%的总血糖反应。在大鼠肝癌细胞中，BMP-6通过下调磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase，PepCK)表达抑制而糖异生和葡萄糖输出。Guo等[19]通过检测骨痂和骨中BMP-6的数量来评估股骨骨折愈合情况，发现非糖尿病和糖尿病动物骨痂和骨折骨中BMP-6的表达显著升高。然而，与非糖尿病对照组相比，糖尿病动物BMP-6水平显著降低，钙化骨痂较小，愈合骨的承载能力较差，证实了糖尿病动物骨折延迟愈合可能与BMP-6缺乏有关。Wang等[20]发现从1型糖尿病(type 1 diabetes mellitus，T1DM)。供体中分离的骨髓间充质干细胞(bone derived mesenchystem cells，BMSCs)比非T1DM供体的骨髓间充质干细胞诱导成骨的能力更低，加入外源性BMP-6培养后，T1DM供体的骨髓间充质干细胞的成骨得以恢复，而BMP-6治疗似乎并不影响非T1DM对照细胞。在腹腔注射BMP-6减轻了糖尿病小鼠的骨丢失，增加了骨密度(bone mineral density，BMD)。故BMP6可能对于T1DM的骨再生有着更为突出的作用。

4 骨形态蛋白-7的临床研究进展

骨形态蛋白-7(bone morphoprotein-7，BMP-7)和BMP-6的氨基酸序列有87%相似的同源物，是一种存在于血液中的细胞因子。BMP-7也可以促进2型糖尿病小鼠的胰岛素分泌和改善其胰岛素敏感性，从而降低血糖[21]。除了上述提到的可降解生物及金属支架，Mantripragada等[22]制备了可注射的壳聚糖微粒子，该方法通过去除油脂或有毒化学物质，并利用低温和压力稳定生长因子。将200 ng BMP-7通过封装和涂层两种方法加入到壳聚糖微粒子中，这些微粒在体内测试，确定6周和12周大鼠股骨骨缺损的生物学反应，组织学显示6周时微颗粒周围有轻微炎症反应，12周时炎症反应减少，Micro-CT分析发现，含微颗粒组的骨表面密度和孔隙率显著更高，这表明在微颗粒存在下形成的新骨具有更强的互连性和多孔性，光子显微镜进行的胶原原纤维分析显示，含微粒子组的胶原束的形成显著改善。Chen等[23]的研究表明，腺病毒介导的BMP-7表达促进了人成纤维细胞的成骨分化并增强了体外成骨细胞相关基因的表达。在注射人成纤维细胞-水凝胶混合物后，感染BMP-7腺病毒的细胞在体内显示出增强的骨形成和成骨细胞相关基因的表达。上述研究表明BMP-7显著促进人成纤维细胞成骨，并证实用表达BMP-7的腺病毒感染人成纤维细胞是骨组织工程的有用工具。

另外，Yuan等[24]检测到类风湿性关节炎(RA)和强直性脊椎炎(AS)患者血清BMP-7和HO-1水平升高。此外，RA和AS患者血清HO-1、BMP-7和Runx2水平与其他常见骨标志物显著相关，但与疾病活动性评分无相关性。发现HO-1和BMP-7有很高的潜力参与RA和AS致病骨代谢的基本病理过程。因此，BMP-7可能对炎症性骨关节病的潜在治疗应用可进一步研究。

5 骨形态蛋白-9的临床研究进展

骨形态发生蛋白-9(bone morphogenetic protein-9，BMP-9)一种由肝脏产生和分泌的生物分子[25]，存在于血液循环中，具有抗肝纤维化[26]、抗肿瘤、抗心力衰竭和抗糖尿病等多种作用。BMP-9同时能明显诱导干细胞骨向分化，这种活性明显强于已用于临床的BMP-2和BMP-7,是目前已发现诱导干细胞成骨分化能力最强的因子之一[27]。目前的研究已经发现了BMP-9可以与多条关键信号通路(如BMP-9-SMAD、BMP9-MAPK、BMP9-TGFIB、BMP9-Wnt/B-catenin与BMP-9-Notch信号通路)共同发挥调控作用[28]。Zhou等[29]的研究中发现BMP-9通过上调LGR6和激活Wnt/beta-catenin通路而促进骨形成，还通过抑制Akt-NF-kappa B- nfatc1通路抑制NF-kappa B受体激活体配体(RANKL)诱导骨髓巨噬细胞的破骨细胞分化而抑制骨吸收，从而提高了去卵巢小鼠的骨密度，恢复了骨微结构，改善了骨生化特性。BMP-9作为一种新型骨形成和骨吸收双重调节剂在绝经后骨质疏松症中的潜在治疗应用值得进一步研究。

哺乳动物的再生能力较差，对创伤性损伤的典型反应是纤维化愈合[30]，使用发育因子在非再生截肢伤口重新启动形态发生是增强哺乳动物再生反应的一种策略[31]。在关节发育过程中，滑膜腔的形成是关节形态发生的中心，而缺乏BMP-2拮抗剂Noggin11的手指滑膜腔的形成失败，提示调节BMPs信号是关节形态发生的必要条件。BMP-2能够诱导残端骨，但不能再生关节及远端骨[32]。Yu等[33]的研究发现BMP-9诱导的关节再生需要蛋白多糖4(Prg4)基因，BMP-2和BMP-9的连续治疗可以刺激骨和关节细胞的再生，否则将经历纤维化愈合。因此Prg4基因有望成为诱导BMP-9刺激骨及骨关节再生的基因治疗靶点。

6 小结与展望

在临床上，外源性所致的骨缺损以及骨骼动态平衡改变为特征的多种疾病导致的代谢性骨疾病较为常见，因此更加精准、高效的定向调控骨干细胞的分化成为当下需要解决的难题。骨形态蛋白具有骨组织的修复与再生功能，目前研究较多的BMP-2、BMP-4、BMP-6、BMP-7、BMP-9在刺激骨干细胞分化的机制上非常复杂，在临床的应用上也面临着很多的挑战，BMP2在体内存活时间短，且具有初始暴发性释放的特点，因此如何稳定持续释放是其要解决的难题，BMP-4在促进骨再生能力比BMP-2更弱一些，例如小檗碱、杜仲、淫羊藿苷及稳定支架的应用成为当下研究热点，此外BMP-4具有调节全身葡萄糖稳态和胰岛素抵抗的作用。BMP-6、BMP-7为相似同源物，它们对维持葡萄糖稳态发挥重要作用，因此在代谢性骨病的治疗中有潜在价值。BMP-9被目前已发现诱导干细胞成骨分化能力最强的因子之一，具有双重调节作用，且在骨关节及远端骨的再生上具有独特作用。