eEF2K在癫痫突触可塑性的研究进展*

杨茜3

(1. 右江民族医学院病理诊断与疾病中心，广西 百色 533000；2. 右江民族医学院附属医院临床病理科，广西 百色 533000；3. 右江民族医学院附属医院神经科学研究实验室，广西 百色 533000)

癫痫是一种反复发作的慢性脑部神经系统疾病，全世界有超过7000万人受累[1]。癫痫发作是由于兴奋性和/或抑制性突触传递失调引起的神经元异常放电导致。γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)是一种抑制性神经元，通过超极化抑制其突触后靶点，为兴奋性神经传递提供必要平衡。Heise C等[2]通过eEF2K基因敲除小鼠和体外实验发现，eEF2K可以负向调控GABA，打破神经元兴奋性与抑制性之间的稳态，诱导癫痫的发生。激活eEF2K，不仅可以诱发癫痫发作，还参与了学习和记忆能力的调节。目前可用的癫痫药物虽然可以缓解癫痫发作，但没有改变潜在致病过程。长期反复癫痫发作的患者仍伴有学习、记忆能力的下降，而背后的分子信号机制却令人难以捉摸。

突触可塑性是指突触对其神经元回路中的活动做出适应改变的能力。长时程增强(long-term potentiation,LTP)和长时程抑制(long-term depression，LTD)是两种编码记忆的突触可塑性形式。这种突触传递强度的长期变化被假设为支持信息存储，因此突触可塑性被认为是构成学习与记忆的基础。大量证据表明，蛋白质从头合成和mRNA翻译是持久记忆和突触可塑性形成的必要条件[3]。激活eEF2K诱导eEF2磷酸化并抑制eEF2活性，阻碍核糖体沿着mRNA移动合成蛋白质[4]。因此，eEF2作为蛋白质合成的重要调节因子，是突触可塑性、记忆巩固作用的潜在调节因子[5]。最近研究表明，阿尔兹海默症(Alzheimer’s disease，AD)存在LTP功能减弱，这是由于AD中存在eEF2过度磷酸化，导致海马CA1区LTP损伤加重学习和记忆缺陷[6-7]。癫痫与AD存在共病——学习和记忆能力下降，我们有理由认为癫痫患者中学习和记忆能力下降是eEF2/eEF2K通过调节突触可塑性功能来发挥了重要的细胞学机制。

1 eEF2K结构与功能

eEF2K活性依赖于钙/钙调蛋白(Ca/CaM)的调节，又被称为钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅲ(CaMKⅢ)。eEF2K的结构与常规的蛋白激酶不同，在序列上与主要的蛋白激酶超家族(丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸激酶)具有有限的相似性和同源性[8]。

细胞和生物体的生存都需要蛋白质合成来维持，而eEF2K使eEF2在Thr56位点上发生磷酸化，抑制其与核糖体的相互作用，阻碍蛋白的合成[4]。eEF2磷酸化与蛋白质从头合成的减少有关，Beckelman BC等[6]在证明Tg19959 AD模型小鼠中存在p-eEF2高表达的情况下通过翻译表面传感(SUnSET)方法检测到小鼠海马区蛋白质从头合成显著减少。这进一步验证了eEF2/eEF2K在mRNA翻译的延伸期调控中发挥核心作用，eEF2去磷酸化是促进蛋白质合成的重要角色。

2 eEF2K活性的调节

eEF2K的活性除受钙离子调节外，还受多种通路的调控。目前已知的影响eEF2K活性的上游分子有mTOR、AMPK和ERK[8]。mTOR是细胞营养及能量维持的重要传感器，是eEF2K重要的上游分子，可以负向调节eEF2K活性，解除对eEF2的抑制[9]。mTORC1在Ser70、Ser78、Ser359、Ser392、Ser396、Ser470、Ser2448和Ser2481位点上抑制eEF2K的活性，阻止eEF2磷酸化，诱导蛋白质合成[10-11]。mTORC1还可能激活核糖体蛋白S6激酶(S6K)，促进eEF2K在Ser366处被S6K磷酸化[12]。有趣的是，抑制eEF2K活性不能反向影响mTORC1信号传导，p-mTOR(S2448)及其2个已知的下游底物p-70S6K(Thr389)和p-4EBP1水平没有改变[13]。

ERK是eEF2K另一个的负向调控因子，包括ERK1和ERK2，在细胞周期中起到调节细胞生长和G1/S转换作用[14]。ERK可以通过两种不同的方式调节eEF2K的活性，第一种涉及eEF2K在Ser359的直接磷酸化，导致eEF2K失活[14]。第二种方式是ERK通过诱导p90核糖体蛋白S6激酶(p90RSK)使eEF2K的Ser366位点磷酸化，导致其失活[12]。在2007年一项研究中，eEF2K的Ser377位点也被ERK信号磷酸化[14]。此外，ERK1/2通过激活CDKs和mTOR途径驱动某些癌症的发展，导致细胞周期进展和蛋白质合成。反之，ERK1/2的过度激活可以导致细胞增殖停滞、细胞凋亡、自噬和衰老。ERK1/2的活性不仅受外源正信号的介导，还受内源性负信号的介导，如AMPK[15]。ERK通路在神经性疾病受到的关注相对较少，在癌症中有更深入的研究。

除Ca2+/CaM可以正向调节eEF2K外，AMPK也被认为是eEF2K活性的正调控因子[16]。AMPK是一种关键的能量传感器，它通过调节细胞内代谢来维持能量稳态。研究发现AMPK激活后通过磷酸化eEF2K来抑制蛋白质延伸以保存能量，它还可以促进p53的磷酸化，阻止DNA合成，导致G1期细胞周期停滞[17]。在细胞ATP低下的情况下，AMPK可通过多个位点磷酸化激活eEF2K，而新发现的Ser398[18]或Ser491/Ser492[19]对eEF2K在Ser366的磷酸化产生负面影响[14]。多种细胞应激可以激活AMPK并增加eEF2 Thr56磷酸化，比如已被证实的有营养剥夺[14]、核糖体应激[20]和pH值的变化[21]。其中营养剥夺诱导的AMPK激活阻断了eEF2K和双特异性丝裂丝溶蛋白激酶(MEK)1/2之间的相互作用，导致MEK1/2-ERK1/2核糖体蛋白S6激酶α-1(P90RSK)-eEF2K-MEK1/2信号环被破坏，从而导致ERK1/2的失活[14]。

eEF2K似乎还参与了关键信号分子的激活，如PI3K/Akt、Src/FAK、MAPK、整合素β1、MCP1、细胞周期蛋白D1和c-myc以及肿瘤微环境[22]。除外在的信号通路调节外，eEF2K也受自身磷酸化调节，Ser78、Ser359和Ser366磷酸化导致p-eEF2水平降低，促进蛋白质合成增加，而Ser392、Ser398和Ser499残基的磷酸化导致eEF2K激活和蛋白质合成减少[22]。上述表明，eEF2K的活性受不同途径的密切调控，但目前活性调节的确切机制尚不清楚。

3 eEF2/eEF2K在突触可塑性改变的作用

eEF2/eEF2K信号通路通过调节突触可塑性的形式来影响记忆形成，常见调节类型为代谢型谷氨酸受体依赖性LTD(deficiency of metabotropic glutamate receptor 5-dependent LTD,mGluRLTD)和脑源性神经营养因子(drain-derived neurotrophic factor，BDNF)诱导LTP[23-24]。在老年APP/PS1 AD模型小鼠中，加用eEF2K基因的抑制剂NH125后降低了eEF2磷酸化，挽救了小鼠海马mGluR-LTD缺陷[25]。eEF2K另一高度选择性抑制剂A484954不仅通过抑制eEF2K活性来增强海马突触传递，还增加海马神经元的活性[26]。Beckelman BC[6]在eEF2K+/-和Tg19959 /eEF2K+/-AD模型中同样发现eEF2K基因减少抑制eEF2过度磷酸化，改善Tg19959AD模型LTP的损伤，但不影响β-淀粉样蛋白病理改变。目前与X染色体相关的智力障碍蛋白聚谷氨酰胺结合蛋白1(PQBP1)被定为翻译延伸和mGluR-LTD的新型调节剂，特异性结合非磷酸化eEF2并抑制eEF2K介导的磷酸化来调节海马mGluR-LTD和mGluR-LTD相关行为[27]。老年小鼠随着年龄增加，LTP也会减弱，而抑制eEF2K，减低eEF2的磷酸化，可以缓解AD小鼠在新物体识别实验(new object recognition，NOR)和水迷宫实验(morris water maze，MWM)任务中的记忆缺陷[6]。在前期研究中，给予小鼠腹腔注射锂-匹罗卡品诱导小鼠癫痫发作，并对其进行了场景恐惧行为学测试，结果显示慢性癫痫小鼠恐惧记忆的形成及对场景恐惧记忆的回忆均受到了损害，而且LTP明显减弱[28]。这些数据表明，不管是AD或癫痫小鼠，eEF2/eEF2K分子通过改变突触可塑性来损害了学习记忆能力。

脑源性神经营养因子(BDNF)是调节突触可塑性的核心因子，调节着海马体和其他脑区LTP[24]。当eEF2K失活，eEF2去磷酸化增加海马BDNF蛋白合成[5]。靶向破坏BDNF基因的小鼠表现出SC-CA1突触的基础突触传递和LTP改变，这可以通过外源性应用重组BDNF来挽救。在PD患者和PD动物模型中也存在突触可塑性改变和认知障碍现象，检测海马(CA1和CA2区)中eEF2K活性增加，纹状体、黑质内侧核和迷走神经背核(DMX)的eEF2K表达增加[7]，在黑质纹状体通路中发现BDNF水平降低[29]。AD模型小鼠也表现出一致的现象，但经过八臂迷宫和Y-maze水迷宫训练后，空间记忆的提高增加了海马的BDNF mRNA水平，也改善了LTP的损伤[30]。eEF2K减少抑制AD小鼠相关的eEF2过度磷酸化，改善了记忆缺陷和海马长时程增强(LTP)的损伤,从而挽救突触收缩。

树突棘是神经元突触输入的主要位点，神经元可塑性的形态相关性由树突棘的密度和形态表示。树突棘的数量或形状的变化与突触可塑性、学习和记忆密切联系[31]。eEF2K的减少减轻了树突棘形态、突触后密度形成、从头蛋白质合成和树突多核糖体组装方面的AD相关缺陷[6]。BDNF通过激活翻译起始和延伸过程诱导树突中的局部蛋白质合成[32]。这是由mTORC1-真核引发因子4E结合蛋白(4EBP)信号传导和mTORC1- eEF2信号传导的介导的[33]。综上认为，eEF2/eEF2K路通对学习、记忆的影响主要体现在改变突触可塑性的活性和形态及从头蛋白合成，并通过多条通路实现。

4 eEF2/eEF2K在癫痫中的作用

癫痫是最常见的神经系统疾病之一，除表现出复杂的癫痫发作外，认知障碍、学习/记忆、行为灵活性、精神疾病(如抑郁症、焦虑症、精神病和自闭症谱系障碍)可合并存在[34]。GABA的紊乱被认为是癫痫发作的关键，eEF2K负向调控GABA释放，导致神经元兴奋性和抑制性突触传递之间的不平衡，增加癫痫的易感性[2]。另一项研究描述了在原代培养的海马细胞中特异性抑制eEF2K导致不规则神经元活动变得同步化[42]。

众所周知，慢性癫痫患者除反复癫痫发作外还合并有学习和记忆能力减弱现象。激活eEF2K活性诱导癫痫发生同时，还抑制相关蛋白合成及导致突触可塑性失调，加重认知障碍。突触蛋白(synapsins)在神经传递中受到阻碍，突触功能、突触形态的选择性分布都可导致兴奋性和抑制性突触传递之间的紊乱，导致癫痫发生[22]。eEF2/eEF2K通路在mRNA翻译水平上调节海马区兴奋性/抑制性平衡，该通路的抑制将平衡推向抑制性一侧，而Synapsin1-KO小鼠eEF2K的遗传或药理学缺失可能挽救该小鼠的癫痫发作[2]。确实，与WT小鼠以及synapsin1/eEF2K双KO小鼠相比，Synapsin1-KO小鼠表现出强烈的癫痫表型[2]。有趣的是，磷酸化eEF2的水平在Synapsin1-KO中含量比WT高3倍多，当它经eEF2k抑制剂NH125处理后磷酸化eEF2归一化到WT水平时，Synapsin1-KO小鼠的癫痫表现得到解救[2]。Guo D等[35]研究人员发现在创伤后继发性癫痫小鼠组中，mTOR信号通路异常激活。给予雷帕霉素治疗后，在长达4个月的视频追踪过程中，研究人员发现雷帕霉素可以缓解甚至逆转创伤后继发性癫痫小鼠的癫痫发作。Yang F等[36]建立了一个黑素细胞系mTOR过度激活的小鼠模型(Mitf-M-CreTsc2KO mice；cKOmice))，研究mTOR通路在黑色素生成中的调节作用，令人意外的是，这个小鼠模型出现了自发性复发性癫痫。eEF2K是 mTOR 信号通路中重要的靶物之一，并与蛋白质翻译密切相关，因此，mTOR-eEF2K分子信号传导通路可能是研究癫痫发病机制的重要的候选通路之一。

Taha E等[8]发现eEF2/eEF2K通路是海马神经发生的上游，eEF2控制海马齿状回(dentate gyrus，DG)中神经发生相关蛋白的表达。当DG兴奋性成熟神经元中eEF2K-KO可增加幼龄小鼠神经发生水平，改善海马依赖性行为，并使老龄小鼠的认知能力恢复至幼龄小鼠的认知能力[8]，说明eEF2/eEF2K信号对于成熟DG的神经发生和特定相关行为能力起着关键作用。而调控eEF2磷酸化可以改变DG的兴奋/抑制平衡，同时改善对癫痫的抵抗[2]。eEF2/eEF2K也可定位于突触后间隙，Ca2+通过突触后通道内流，以及从内部储存释放，激活神经元树突中eEF2/eEF2K通路，在过程中NMDA受体与谷氨酸结合介导的突触后Ca2+内流[5]，这也就是说明激活NMDA受体可提高细胞内Ca2+水平，引起神经元兴奋性增加，诱发癫痫发作，而eEF2K介导的eEF2磷酸化参与其中。突触活动中除了NMDA型谷氨酸受体之外，MEK/ERK和mTORC1通路的调节，以及AMP激酶的调节，也可导致eEF2K活性快速而短暂的增加[4]。重要的是，突触活动诱导的神经元mTORC1和MEK/ERK的刺激需要Ca2+内流。综合起来，这些发现强烈表明eEF2K通过影响兴奋/抑制平衡，成为治疗疾病系统疾病，包括但不限于癫痫[2]。

5 结语

eEF2K在调整蛋白质合成和特定mRNAs的翻译中的作用越来越清楚。人们对于eEF2/eEF2K在癫痫/致痫发生和其他神经系统疾病中的研究越来越深入，但仍缺乏关于癫痫发生及反复抽搐导致的学习和记忆能力的下降神经病理生理学的确切机制的信息，以及这种独特的激酶及其底物在神经系统疾病蛋白翻译功能障碍的作用。目前存在很多eEF2K有效的抑制剂，但作用仍是局限的。为了将eEF2/eEF2K靶向治疗药物用于各种神经系统疾病的临床研究，开发更多的分子抑制剂在内的高效、特异的治疗策略仍然是当务之急。