软骨调节素Ⅰ的研究现状和进展

周连仲 冯 勇 刘 玮 周子宁 张建新

天津市第四中心医院 南开大学附属第四中心医院 天津市耳鼻咽喉头颈外科医院耳鼻咽喉头颈外科 300000

软骨调节素(ChM)是一族新的软骨特异性蛋白，它的家族包括ChM-Ⅰ、ChM-Ⅱ、ChM-Ⅲ三种生物因子[1]，ChM-I是最早被明确的软骨调节素。 ChM-I的生物学作用表现为刺激软骨细胞DNA和基质合成，能够促进软骨细胞和体内软骨的快速生长；抑制血管发生，能够抑制血管长入软骨内，进一步抑制软骨内骨化和骨的形成。本文将对ChM-Ⅰ的研究进展加以概述。

1 ChM-I的结构

人们在研究刺激软骨生长的因子的过程中发现一种软骨提纯物,其刺激软骨细胞的活性和TGF完全不同。这种提纯物为ChM-Ⅰ，是一种由121个氨基酸构成的糖蛋白，相对分子质量为25 000。其在胎牛软骨细胞外基质中大量存在，具有促进软骨细胞增生和蛋白多糖合成的作用。为了更好地研究ChM-Ⅰ的功能，人们对其蛋白结构进行了分析：成熟的ChM-Ⅰ蛋白质在其C末端带有3个糖基化位点，由1个疏水区和8个半胱氨酸构成；其N端，具有很高的亲水性。Yanagihar等[2]以人ChM-Ⅰ的cDNA作为探针，从人基因组粘粒文库中筛选出两组含有ChM-Ⅰ的cDNA的克隆，对其进行核苷酸序列分析，发现ChM-Ⅰ基因是由7个外显子和外显子—内含子边界构成的。利用所获得的克隆为探针，进一步研究，发现人的ChM-Ⅰ基因位于染色体13q14-21处，编码334氨基酸Ⅱ型跨膜糖蛋白。

2 ChM-Ⅰ的表达与调控

2.1 ChM-Ⅰ在软骨组织中的表达 ChM-Ⅰ最早是在骨骺软骨中被发现并分离出来。人们在正在发育的牛尾椎软骨组织中检测到了ChM-Ⅰ的表达；而在牛的软骨膜和肌肉等非软骨组织中并未检测到ChM-Ⅰ的表达。ChM-Ⅰ这种在软骨组织中特异性表达的特性，提示其表达可能是软骨细胞分化表型的一部分。 Shukunami等[3]采用Northern blot分析显示，ChM-Ⅰ转录子的表达与胎龄11～17d时表达Ⅱ塑胶原的软骨形成相关，此时软骨骨基正在被骨替代。同时，ChM-Ⅰ的mRNA在眼及胸腺中有低水平的表达。原位杂交显示ChM-Ⅰ在13.5～16d的小鼠胚中所有软骨样组织中均有大量的表达。在退化的软骨组织中，ChM-Ⅰ的mRNA的表达是几乎不存在的。并且转录子的表达随着肥大软骨细胞X型胶原的出现而下降。

2.2 不同种属间ChM-Ⅰ的表达 研究发现，不同种属间ChM-Ⅰ的表达是有所差异的。Shukunami等[4]对鸡的ChM-Ⅰ的cDNA核苷酸序列进行分析：发现鸡的成熟的ChM-ⅠN端亲水区序列要比哺乳动物的长，其原因可能是由于多腺苷酸化信号的交替使用，使鸡的胚胎可以表达多种不同大小的转录子(3.7、2.0和1.7kb)，但哺乳动物仅表达一种转录子(1.7kb)。在鸡的胚胎发育早期，在体节、心脏、支气管弓、视网膜和肢芽中可检测到ChM-I的mRNA的表达；在发育后期，ChM-I的mRNA的表达仅局限于软骨及眼。在鸡的胚胎发育过程中，ChM-Ⅰ的表达并不是只局限在无血管的软骨区，其转录子在脊索、神经管底板及顶板和软骨前体组织如:体节生骨节、发育中的四肢及咽弓、耳道及巩膜中也有表达。

2.3 ChM-Ⅰ的调控 Aoyama等[5]在骨肉瘤细胞系中研究ChM-Ⅰ基因表达的分子机制时发现，ChM-Ⅰ基因DNA甲基化与去甲基化作用和组蛋白的乙酰化与去乙酰化作用之间的转化,在ChM-Ⅰ的基因表达调控中也起着重要的作用。PI3K/AKT信号的下游缺陷可能会影响mTOR网络，导致细胞凋亡。在颞下颌关节(TMJ)的穿孔盘中，血管生成似乎受NF-κB途径的调控，与健康盘相比，ChM-Ⅰ在穿孔盘中的表达明显较低，似乎在白细胞介素-1β(IL-1β)的存在下通过NF-κB途径进行调控，将ChM-Ⅰ与受体介导的NF-κB信号和TMJ的病理血管生成联系起来[6]。

3 ChM-I 的生物学作用

3.1 在软骨生长、软骨损伤修复及软骨、椎间盘退变中的作用 ChM-Ⅰ具有刺激软骨细胞DNA和基质合成的作用，能够促进软骨细胞和体内软骨的快速生长。ChM-Ⅰ与FGF-2具有协同作用，而且具有浓度依赖性，当ChM-Ⅰ的浓度达到200ng/ml时，ChM-Ⅰ刺激软骨细胞生长的活性最强，这些发现表明ChM-Ⅰ在软骨的生长过程中起着特殊的作用。研究表明[7]，正常发育成年鼠健康关节软骨中可检测到大量ChM-Ⅰ蛋白的表达；在骨关节炎早期，浅表关节软骨中的ChM-Ⅰ蛋白表达有所减少；在骨关节炎进展期，所有关节软骨中的ChM-Ⅰ蛋白表达均减少，血管内皮生长子的表达反而增加。据此笔者推测：在关节软骨的正常生长和无血管特性的维持过程中ChM-Ⅰ起着重要的作用，其表达的下调可使血管侵入关节软骨，并最终导致软骨的骨化和骨关节炎的发生。研究发现[8]，退变初期的椎间盘中，ChM-I的表达反而有所升高。笔者推测ChM-Ⅰ在退变初期的增多是为了阻止椎间盘退变的进展，ChM-Ⅰ在维持软骨组织的完整性中发挥着保护性作用。另有证据表明ChM-Ⅰ的表达与骨关节炎可能有关，在软骨细胞分化和软骨的调控中维持内稳态。综合以上研究结果，笔者发现ChM-Ⅰ在软骨生长、软骨损伤修复及软骨、椎间盘退变中发挥着重要作用，但具体机制仍需进一步研究。

3.2 在心脏瓣膜中的作用 研究证明[9]：在维持心脏瓣膜正常功能的过程中，ChM-Ⅰ具有重要的作用。它阻止心脏瓣膜中新生血管的形成，而这一过程很可能导致心脏瓣膜病的发生。炎症诱导的新血管重建是感染性心内膜炎(IE)发展的一个致病性特征。在IE早期的瓣膜组织中，ChM-Ⅰ的表达被下调，这可能导致血管重建和心内膜炎的进展，与 ChM-Ⅰ水平的降低引起的免疫介导的炎症反应的结果。此外，缺氧相关的ChM-Ⅰ表达降低也可能是中晚期瓣膜疾病进展的一个因素。在植入过程中，ChM-Ⅰ被证明对滋养细胞的迁移和入侵有抑制作用，这意味着ChM-Ⅰ可能会影响胚胎发育过程中组织分化和血管生成的调节。还需要进一步的研究来促进我们对ChM-Ⅰ在感染性心内膜炎的发展和胚胎发生中作用的理解。

3.3 在抑制内皮细胞及血管形成中的作用 软骨由于存在大量的抗血管形成因子，而表现出无血管化状态。然而在软骨内骨化过程中，其钙化中心是允许血管长入的，这也是骨替代软骨的开始。软骨的血管化和无血管化的状态改变，在软骨内成骨过程中起关键的作用。在体外试验中，观察到ChM-Ⅰ具有抑制血管内皮细胞的增殖和管状的形成。ChM-Ⅰ抑制血管形成的作用已得到广泛的认同。 Shigenori Miura等[10]研究人重组软骨调节素在小鼠角膜血管形成中有抵抗血管形成的作用。他们主要关注VEGF-A介导的血管内皮细胞的迁移这一步骤，此步骤是血管形成中关键的调控步骤。分别用VEGF、FGF-2和IGF-1介导人脐静脉内皮细胞的超化性迁移，加人人重组软骨调节素Ⅰ(rhChM-Ⅰ)浓缩液阻滞这一过程，并用改良后的趋化实验装置进行分析，发现ChM-Ⅰ的功能是建立在内皮细胞黏附的独立性和专一性之上的。这一作用与细胞伸展的阻滞和在VEGF刺激下的肌动蛋白细胞骨架的断裂重组有关。与这些观察相一致，在细胞扩展期间，rhChM-Ⅰ明显降低了Rac1/Cdc42的活力，在静止期的细胞，VEGF 介导的Rac1活力并不是它的基本活力。综上所述，目前的数据显示，ChM-Ⅰ损伤了内皮细胞由VEGF-A刺激所产生的活力，进而阻止内皮细胞的生长。

3.4 在抗肿瘤中的作用 研究表明[11]，ChM-Ⅰ的抗血管生成特性可以抑制肿瘤的生长、传播和转移，这表明ChM-Ⅰ功能的丧失可能会诱导肿瘤的发生。ChM-Ⅰ已被证明可以抑制体内人骨肉瘤细胞的生长和增殖，并抑制体外人骨肉瘤细胞的侵袭和迁移。研究发现[12]ChM-Ⅰ在胃癌中的表达下调，ChM-Ⅰ似乎是一种潜在的肿瘤抑制剂，这也可能成为胃癌治疗和预后的重要生物标志物。ChM-Ⅰ在多种内分泌肿瘤(MEN)中有所表达，在多形性腺瘤的发病机制研究过程中，也检测到ChM-Ⅰ的表达，这表明它有可能参与了多形性腺瘤的低血管性和软骨体的形成。在细胞水平上，ChM-Ⅰ似乎能够通过以剂量依赖关系促进细胞增殖和抑制肿瘤细胞的生长来表现出双重作用。低浓度的ChM-Ⅰ似乎可以促进成骨细胞的生长，而高浓度的ChM-Ⅰ抑制了肿瘤细胞的生长和迁移，如人宫颈癌(HeLa)细胞和人神经母细胞瘤(SH-SY5Y)细胞，并抑制了人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的增殖和血管生成[13]。ChM-Ⅰ通过抑制STAT信号通路来发挥直接的抗肿瘤作用。ChM-Ⅰ还能够通过调节细胞周期相关基因的表达水平来抑制乳腺癌细胞的生长，因此可能对治疗乳腺癌有潜在的临床应用[14]。总的来说，这些发现提示ChM-Ⅰ在各种癌症的发病机制中起作用，与ChM-Ⅰ调节软骨细胞分化和抗血管生成特性有关。ChM-Ⅰ在癌症发病机制中的作用需要进一步的研究，以开发其作为癌症治疗的新靶点。

3.5 在软骨组织工程中诱导骨髓间充质干细胞的作用 骨髓间充干细胞因其具有多向分化潜能，在组织工程中的应用前景越来越好，受到越来越多的学者的关注。因生物因子对诱导种子细胞向软骨细胞分化、增殖的关键作用而成为软骨组织工程的一个重要研究方向。翟立杰所带领的课题组在这方面做了大量的工作。他们利用基因芯片筛选大鼠MSCs和透明软骨及弹性软骨细胞差异表达基因，发现ChM-Ⅰ基因在MSCs中低表达，而在透明软骨及弹性软骨细胞中高表达[15]。通过生物信息学检索结果提示，ChM-Ⅰ可能在诱导MSCs向软骨细胞方向分化过程中起关键作用。Western blot发现在透明软骨细胞和弹性软骨细胞中ChM-Ⅰ的表达明显高于MSCs，推测ChM-Ⅰ可能成为诱导MSCs向软骨细胞分化的一个重要的生物因子。

4 展望

ChM-Ⅰ是软骨源性的生长因子，同时也是一种血管生成抑制剂，其可以调控软骨的形成，刺激软骨细胞的生长，对软骨的无血管化的维持起重要作用。ChM-Ⅰ在抵抗软骨退化方面的研究也有很多报道，但关于其分子机制，如ChM-Ⅰ作用的受体、受体结构及理化性质以及生长因子介导的细胞内信号传递过程的研究很少。ChM-Ⅰ抑制血管生成的作用，在实体肿瘤的治疗中展示了很好的应用前景，同时也有ChM-Ⅰ直接抑制肿瘤细胞生长方面的研究及相关作用机制的探讨，但仍缺乏更广泛深入的研究。另外，对ChM-Ⅰ在软骨组织工程领域的应用也有学者开展了相关的研究，具有很好的研究前景。现代分子生物学技术迅猛发展，ChM-Ⅰ的基因及蛋白质结构的研究也在不断深入，已提纯得到了ChM-Ⅰ重组蛋白，并在体内及体外实验中验证了其功能的有效性。相信在不远的将来，对ChM-Ⅰ的研究必将有更进一步的发展，其在临床应用方面的价值也会不断展现，最终为相关临床疾病的治疗带来新的方法。